[發明專利]一種誘導干細胞分化為心肌細胞的方法及其培養基組合

在審

• 申請號: 202210378168.0
• 申請日: 2022-04-12
• 公開（公告）號: CN114591895A
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 陳國凱;劉蔚蔚
• 申請（專利權）人: 澳門大學
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C12N5/077
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 覃蛟

1.一種誘導干細胞分化為心肌細胞的方法，其特征在于，其包括以下步驟：采用第一分化培養基將干細胞誘導分化至中胚層；

使用第二分化培養基對所述中胚層進行誘導分化，所述第二分化培養基中添加有6～10mmol/L酸或在誘導分化的過程中添加酸使得酸在第二分化培養基中的終濃度為6～10mmol/L。

2.根據權利要求1所述的誘導干細胞分化為心肌細胞的方法，其特征在于，所述酸包括：鹽酸和乳酸中的至少一種；

優選地，所述第二分化培養基的pH為6.2～6.9；

優選地，所述第二分化培養基由在基礎分化培養基中添加所述酸配制獲得；

優選地，所述第二分化培養基中還添加有WNT抑制劑，或在第二分化培養基誘導培養細胞的過程中添加WNT抑制劑；

優選地，所述WNT抑制劑為IWP-2、IWR-1和XAV939中的任意一種；

優選地，當WNT抑制劑為IWP-2時，所述WNT抑制劑在第二分化培養基中的終濃度為3～5μmol/L。

3.根據權利要求2所述的誘導干細胞分化為心肌細胞的方法，其特征在于，采用第二分化培養基對所述中胚層進行誘導分化的時長為5～7天；

優選地，當所述方法為在誘導分化的過程中添加酸使得酸在第二分化培養基中的終濃度為6～10mmol/L時，酸的添加時間為采用第二分化培養基對所述中胚層進行誘導分化的第1～6天；

當所述方法為在第二分化培養基誘導培養細胞的過程中添加WNT抑制劑時，WNT抑制劑的添加時間為采用第二分化培養基對所述中胚層進行誘導分化的第1～3天。

4.根據權利要求2所述的誘導干細胞分化為心肌細胞的方法，其特征在于，所述基礎分化培養基的成分包括：DMEM/F12、L-抗壞血酸-2-磷酸鎂、鈉硒、轉鐵蛋白、化學成分明確的脂質濃縮液以及青鏈霉素中的至少一種；

優選地，所述基礎分化培養基中，L-抗壞血酸-2-磷酸鎂的終濃度為50～80mg/L，鈉硒的終濃度為10～20μg/L，轉鐵蛋白的終濃度為1～20mg/L，青鏈霉素的終濃度為1～20U/mL。

5.根據權利要求1～4任一項所述的誘導干細胞分化為心肌細胞的方法，其特征在于，所述第一分化培養基包括：基礎分化培養基以及添加有WNT通路激活劑的基礎分化培養基，或，僅包括基礎分化培養基；

當所述第一分化培養基包括基礎分化培養基以及添加有WNT通路激活劑的基礎分化培養基時，所述將干細胞誘導分化至中胚層的步驟包括：先采用添加有WNT通路激活劑的基礎分化培養基培養干細胞1～2天，再更換為基礎分化培養基對其進行培養，以獲得所述中胚層；

當所述第一分化培養基僅包括基礎分化培養基時，所述將干細胞誘導分化至中胚層的步驟包括：采用基礎分化培養基培養干細胞1～2天過程中添加WNT通路激活劑，再更換為基礎分化培養基對其進行培養，以獲得所述中胚層；

優選地，所述WNT通路激活劑在基礎分化培養基中的終濃度為1～10μmol/L；

優選地，所述WNT通路激活劑為GSK3β抑制劑；

優選地，所述GSK3β抑制劑為CHIR99021和/或CHIR99021 HCl。

6.根據權利要求1～4任一項所述的誘導干細胞分化為心肌細胞的方法，其特征在于，采用第二分化培養基對所述中胚層進行誘導分化后，采用第三分化培養基對細胞進行培養分化，所述第三分化培養基為不添加酸的基礎分化培養基；

優選地，采用第三分化培養基對細胞進行培養分化的時長為2～4天。

7.根據權利要求1～4任一項所述的誘導干細胞分化為心肌細胞的方法，其特征在于，所述干細胞為多能干細胞。

8.根據權利要求7所述的誘導干細胞分化為心肌細胞的方法，其特征在于，所述多能干細胞選自人胚胎干細胞和人誘導多能干細胞中的至少一種。