[發(fā)明專利]基于光控型CRISPR/Cas13d基因編輯系統(tǒng)的基因編輯方法、組合物及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210375019.9
• 申請(qǐng)日: 2022-04-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114774389B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙杰;馬信龍;張楊;郭悅;馬劍雄
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津市天津醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N9/22
• 分類號(hào): C12N9/22;C12N15/113;A61K31/7088;A61K38/46;A61P19/08
• 代理公司: 天津市宗欣專利商標(biāo)代理有限公司 12103
• 代理人: 董光仁

本發(fā)明公開(kāi)了基于光控型CRISPR/Cas13d基因編輯系統(tǒng)的基因編輯方法、組合物及應(yīng)用。本發(fā)明中的光控型CRISPR/Cas13d基因編輯系統(tǒng)在未受到光刺激的條件下游離失活的存在于細(xì)胞內(nèi)；在受到光刺激條件下，結(jié)合形成具有功能的完整的Cas13蛋白酶，與靶向crRNA結(jié)合，特異性的敲低靶基因的表達(dá)。本發(fā)明具有時(shí)間?空間特異性，能夠精準(zhǔn)靶向調(diào)控RNA，從而實(shí)現(xiàn)特異性RNA敲低、編輯和檢測(cè)；進(jìn)一步本發(fā)明能適用于骨折治療，作用于活體局部，脫靶的風(fēng)險(xiǎn)小，生物風(fēng)險(xiǎn)低，為骨折愈合提供新的治療策略，提供了一種Cas13蛋白酶的新用途。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及于基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于光控型CRISPR/Cas13d基因編輯系統(tǒng)的方法、組合物及應(yīng)用。

背景技術(shù)

基于CRISPR系統(tǒng)的第三代基因編輯技術(shù)，具有效率高、操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，是醫(yī)學(xué)研究的最前沿領(lǐng)域?，F(xiàn)階段，正有針對(duì)于β-地中海貧血、鐮刀狀細(xì)胞貧血、多發(fā)性骨髓瘤、Leber先天性黑蒙癥等多種疾病的臨床試驗(yàn)正在開(kāi)展，其安全可行性已在CRISPR編輯T細(xì)胞治療肺癌中得到證實(shí)，具備廣闊的應(yīng)用前景和巨大的市場(chǎng)潛力。

CRISPR基因編輯技術(shù)應(yīng)用于臨床的前提是精準(zhǔn)與可控，開(kāi)發(fā)具有高時(shí)空分辨率的基因編輯技術(shù)，是目前亟需解決的核心問(wèn)題。光遺傳是精準(zhǔn)控制細(xì)胞行為的技術(shù)，具有高度的時(shí)間-空間特異性?，F(xiàn)已經(jīng)報(bào)道了多種光控基因編輯體系，分別將不同效應(yīng)蛋白與CRISPR系統(tǒng)結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)特異性基因編輯和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Cas13d是一種小巧而強(qiáng)大的CRISPR核酸酶，Cas13d酶的平均長(zhǎng)度約為930個(gè)氨基酸，比其他Cas13酶小20％，比Cas9更是小33％。這種尺寸使其更容易包裝到容量較小的載體中，如腺相關(guān)病毒載體。但目前CRISPR/Cas13d系統(tǒng)尚無(wú)有效光學(xué)開(kāi)關(guān)，其潛在的非特異性作用可能影響臨床應(yīng)用。

在骨折治療相關(guān)的醫(yī)療領(lǐng)域，目前認(rèn)為靶向抑制骨硬化蛋白(SOST基因)或DKK-1蛋白(DKK-1基因)有望促進(jìn)骨折愈合。SOST基因主要表達(dá)于成熟骨細(xì)胞中，DKK-1基因主要表達(dá)于成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中，二者均能夠調(diào)控Wnt信號(hào)通路，從而抑制骨形成活動(dòng)?，F(xiàn)有方法主要利用二者抗體進(jìn)行中和治療，存在分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜、生產(chǎn)成本高、需通過(guò)注射給藥等弊端，使其應(yīng)用受到一定限制。相比之下，核酸類藥物擁有明顯的優(yōu)勢(shì)。核酸類藥物基于堿基互補(bǔ)原理對(duì)目的蛋白進(jìn)行調(diào)節(jié)，如CRISPR系統(tǒng)，通過(guò)合適的遞送系統(tǒng)可有效進(jìn)入機(jī)體內(nèi)發(fā)揮作用，避免了傳統(tǒng)小分子化藥和抗體類藥物面臨的靶點(diǎn)不可成藥問(wèn)題。但目前尚未有基于CRISPR技術(shù)促進(jìn)成骨能力及加速骨折愈合的治療方案。本發(fā)明提供了一種光控CRISPR/Cas13d基因編輯方法，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于制備、作用精準(zhǔn)等優(yōu)勢(shì)，可應(yīng)用于靶向抑制SOST和DKK-1促進(jìn)成骨加速骨折愈合過(guò)程。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于光控型CRISPR/Cas13d基因編輯系統(tǒng)的方法、組合物及應(yīng)用。

一方面，本發(fā)明提供了一種光控型CRISPR/Cas13d基因編輯系統(tǒng)，包括分割型Cas13d蛋白酶、由X部分和Y部分構(gòu)成的雙組分光控系統(tǒng)以及靶向crRNA；

所述分割型Cas13d蛋白酶包括Cas13d(N)與Cas13d(C)兩部分，所述Cas13d(N)與Cas13d(C)分別與雙組分光控系統(tǒng)分中的X部分和Y部分相連形成Cas13d(N)-X蛋白和Cas13d(C)-Y蛋白；

所述靶向crRNA包括靶向目標(biāo)基因的向?qū)蛄泻团cCas13d蛋白酶相結(jié)合的骨架序列。

進(jìn)一步的，所述Cas13d(N)與Cas13d(C)由Cas13d蛋白酶從位于非功能區(qū)的切割位點(diǎn)分割開(kāi)得到。

進(jìn)一步的，所述雙組分光控系統(tǒng)為光敏蛋白對(duì)：CIBN-CRY2PHR、pMagnet-nMagnet、iLID-SspB、BphP1-PpsR2、PhyB-PIF、BphP1-Q-PAS1中的任意之一。