[發明專利]肺炎克雷伯菌噬菌體裂解酶及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202210374158.X
• 申請日: 2022-04-11
• 公開（公告）號: CN114807104A
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發明（設計）人: 楊虹林;付志鋒;盧曙光
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;A61K38/51;A61P31/04;C12R1/19
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 武君

本發明公開了氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的肺炎克雷伯菌噬菌體裂解酶，本發明從肺炎克雷伯菌噬菌體DP上克隆得到該裂解酶編碼基因，采用原核表達方式，誘導表達可溶解的裂解酶，所得裂解酶重組蛋白可以在無外膜滲透劑的情況下穿過革蘭氏陰性菌的細胞外膜，水解細菌細胞壁肽聚糖層，對革蘭氏陰性菌例如銅綠假單胞菌和大腸桿菌表現出強烈的抑菌活性，可用于制備抗革蘭氏陰性菌的藥物，為治療和抑制革蘭氏陰性菌疾病提供有力支持；此外，該裂解酶的制備方法簡單，適于工業化大規模生產。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種肺炎克雷伯菌噬菌體裂解酶，其制備方法，以及在制備藥物中的應用。

背景技術

噬菌體裂解酶是雙鏈DNA噬菌體所特有的，在病毒復制晚期合成的一類細胞壁水解酶。其能通過穿孔素在細胞膜形成的孔洞，抵達細胞壁上的肽聚糖靶點，對肽聚糖中的重要化學鍵進行切割水解，最終導致細菌裂解、死亡。噬菌體裂解酶可以選擇性地快速殺滅特定的細菌，且不易產生抗性，不破壞機體的正常菌群，是“精準型”抗菌物質。

針對革蘭氏陽性菌的裂解酶研究已經取得較滿意的進展，而針對革蘭氏陰性菌的裂解酶研究仍面臨著較大的難題。主要原因在于，革蘭氏陰性菌的細胞壁肽聚糖層外面包裹的外膜阻礙了裂解酶與肽聚糖的接觸。該難題有望通過以下途徑克服或解決：(1)鑒定識別能穿透外膜的天然裂解酶；(2)將裂解酶與外膜滲透劑如EDTA、檸檬酸、蘋果酸和陽離子多肽、抑菌劑等協同作用；(3)將裂解酶與一段能滲透外膜的多肽進行融合表達等。

發明內容

著眼于上述問題，本發明的目的之一在于提供一種噬菌體裂解酶，能夠在無外膜滲透劑的情況下單獨發揮作用，對革蘭氏陰性菌表現出強烈的抑菌活性；目的之二在于提供一種所述噬菌體裂解酶的制備方法；目的之三在于提供所述噬菌體裂解酶在制備藥物中的應用。

經研究，本發明提供如下技術方案：

1.肺炎克雷伯菌噬菌體裂解酶，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.所述肺炎克雷伯菌噬菌體裂解酶的編碼基因。

進一步，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.含有所述編碼基因的重組表達載體。

進一步，所述重組表達載體是將核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的肺炎克雷伯菌噬菌體裂解酶編碼基因克隆入原核表達載體pⅡSA的zSUMO標簽序列與eGFP標簽序列之間而得到。

4.含有所述重組表達載體的工程菌。

進一步，所述工程菌是將所述重組表達載體轉入大腸桿菌BL21(DE3)中而得到。

5.利用所述工程菌制備肺炎克雷伯菌噬菌體裂解酶的方法，包括以下步驟：

將所述工程菌接種于含有氨芐青霉素即Amp的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜，次日取菌懸液按體積比1:100接入含Amp的LB液體培養基中，37℃振蕩培養至OD₆₀₀＝0.6，加入IPTG至終濃度為0.5mM，16℃振蕩誘導培養16h，4℃離心收集菌體，用pH8.0 PBS緩沖液重懸，加入蛋白酶抑制劑PMSF至終濃度為1mM，冰浴條件下超聲波間歇破碎菌體，4℃離心，上清液用孔徑0.45μm的過濾器過濾，濾液于4℃條件下以流速1mL/min上Ni-TED柱，用500mM咪唑溶液按1％～100％濃度配比進行梯度洗脫，收集洗脫液，于4℃條件下用pH7.4PBS緩沖液透析，即得肺炎克雷伯菌噬菌體裂解酶，加入甘油至終濃度為20％，-20℃保存。

6.所述肺炎克雷伯菌噬菌體裂解酶在制備抗革蘭氏陰性菌的藥物中的應用。

進一步，所述抗革蘭氏陰性菌的藥物可在無外膜滲透劑條件下單獨發揮抗革蘭氏陰性菌的作用。

進一步，所述革蘭氏陰性菌為大腸桿菌和銅綠假單胞菌。