[發明專利]一種特異識別微囊藻毒素的雙鏈DNA功能化整體柱

在審

• 申請號: 202210368503.9
• 申請日: 2022-04-09
• 公開（公告）號: CN115060906A
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發明（設計）人: 陳永煊;孟鵬;戴明;余清;鄒愚;何孟杭
• 申請（專利權）人: 福建省產品質量檢驗研究院（福建省缺陷產品召回技術中心）
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 福州智理專利代理有限公司 35208
• 代理人: 康永輝

本發明涉及一種特異識別微囊藻毒素的雙鏈DNA功能化整體柱，以熒光標記的堿基互補鏈修飾的核酸適配體鍵合親和整體柱為載體，以5’?SH?適配體與熒光標記DNA組裝產物為熒光探針，通過適配體特異捕獲微囊藻毒素（MC?LR），釋放熒光標記堿基互補鏈，實現微囊藻毒素的特異捕集、激光誘導熒光檢測。所述整體柱以甲基丙烯酸酯丁基聚倍半硅氧烷、季戊四醇三丙烯酸酯作為功能單體，以2,2?二羥甲基丙酸為光引發劑，通過簡單的光引發聚合法即可快速制備。本發明的方法快速靈敏，無需對MC?LR進行熒光標記，實現了MC?LR高靈敏分析。

技術領域

本發明涉及一種特異識別微囊藻毒素的雙鏈DNA功能化整體柱。

背景技術

精準靈敏地識別微囊藻毒素（MC-LR）是開展飲用水安全監測的關鍵之一。微囊藻毒素是一類七肽單環肝毒素，具有強烈的肝腎毒性和免疫系統毒性，可在水及水產品組織中穩定存在。隨著水體富營養化加劇，湖泊、水庫和河灣受到藍藻污染日益嚴重，特別是在太湖、鄱陽等大型湖泊水域受到藻毒素污染而短時暫停部分城市供水事件發生后，水中微囊藻毒素安全問題再次引發社會不安，亟需建立水中痕量MC-LR毒素的高效精準分析技術。

MC-LR毒素分子結構中沒有熒光基團且紫外吸收較弱，難以直接高靈敏地光譜分析檢測。主要分析方法有小鼠分析、細胞毒性檢測、蛋白磷酸酶抑制、酶聯免疫吸附和質譜分析等。其中小鼠分析、細胞毒性檢測主要用于MCs毒性篩查；蛋白磷酸酶抑制法基于MCs對蛋白磷酸酶抑制作用進行MCs總量分析；酶聯免疫吸附法通過抗原抗體酶聯免疫直接定量檢測MCs，特異性強，主要用于定性快速篩查，但是免疫抗體保存和使用條件較為嚴格。現行各類水質和魚類組織中MCs的檢測分析實驗室確證技術主要采用液相色譜-質譜聯用技術，方法靈敏度高，但是質譜設備大型、價格昂貴、操作維護技術要求高，在我國科技經濟欠發達的地方和一線監測實驗室，特別是在現場監測中難以普及，難于快速及時、準確地監測評估MC-LR。發展便捷的痕量MCs高靈敏分析手段很有必要。

發明內容

本發明的目的是在于提出一種特異識別微囊藻毒素的雙鏈DNA功能化整體柱及制備方法和應用。為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種特異識別微囊藻毒素的雙鏈DNA功能化整體柱，以微囊藻毒素適配體與帶有熒光標記的互補寡核酸鏈雜交生成雙鏈DNA修飾有機-無機雜化整體柱，制備特異識別微囊藻毒素的親和整體柱，與微囊藻毒素MC-LR發生管內特異識別，釋放熒光標記的DNA互補鏈，實現MC-LR毛細管柱上激光誘導熒光高靈敏分析。

所述的親和整體柱是由適配體與帶有熒光標記的互補寡核酸鏈雜交生成雙鏈DNA修飾有機-無機雜化整體柱所得；所述的有機-無機雜化整體柱是以低聚倍半硅氧烷為聚合單體和含多烯烴基團的丙烯酸酯為交聯劑、以惰性溶劑為致孔劑、經光引發劑在紫外光照射下聚合而成；所述的聚倍半硅氧烷為聚八甲基丙烯酸酯基籠型倍半硅氧烷，n=8-12，所述的交聯劑為季戊四醇三丙烯酸酯，所述的致孔劑為甲醇、N-N-二甲基甲酰胺組成的二元混合溶液，所述的光引發劑為2,2-二羥甲基丙酸。

所述的有機-無機雜化整體柱，按聚合單體、交聯劑和致孔劑三者質量百分數之和為100 %計，甲基丙烯酸酯異丁基聚倍半硅氧烷占比2.7%~4.5%，季戊四醇三丙烯酸酯占比11.2%~16.0%，甲醇占比64.0%~69.7%，N-N-二甲基甲酰胺占比12.3%~17.2%；所述的光引發劑2,2-二羥甲基丙酸的比例為聚合組成總質量的2.5%。

所述的核酸適配體為5'-SH-C₆-GGCGCCAAACAGGACCACCAT GACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC-3'；熒光標記的寡核酸鏈序列為5'-FAM-CATAAT GAGGTGGTATGGGTAATTGTCAT-3'。

所述的一種特異識別微囊藻毒素的雙鏈DNA功能化整體柱的制備方法，其特征在于：包含以下步驟：