[發明專利]一種用于氧化應激損傷評價的骨髓間充質干細胞培養方法

在審

• 申請號: 202210363253.X
• 申請日: 2022-04-07
• 公開（公告）號: CN114807027A
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發明（設計）人: 林燕平;黃宏興;黃佳純;郭海威;萬雷;朱根福;張志海
• 申請（專利權）人: 廣州中醫藥大學第三附屬醫院（廣州中醫藥大學第三臨床醫學院;廣州中醫藥大學附屬骨傷科醫院;廣東省中醫骨傷研究院）
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12Q1/02;G01N33/68;G01N21/64
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 44288
• 代理人: 成關鍵

本發明提供了一種用于氧化應激損傷評價的骨髓間充質干細胞培養方法，包括以下步驟：(1)取大鼠骨髓組織液，放入離心機進行離心處理，棄上清液后加入安全培養基，取細胞懸液在培養箱中進行培養；(2)傳代培養：加入PBS緩沖液和消化液，靜置消化，加入安全培養基終止消化，離心處理棄上清液，再接種于安全培養基中進行培養，至骨髓間充質干細胞為P3?P4代細胞。本發明用于氧化應激損傷評價的骨髓間充質干細胞培養方法，培養得到的P4代骨髓間充質干細胞，用于氧化應激損傷評價，可以較為真實的模擬BMSCs在成骨分化過程中的氧化應激損傷過程，可以縮短造模時間短，且建立的細胞模型穩定，可操作性強，成本低。

技術領域

本發明屬于細胞培養技術領域，具體涉及一種用于氧化應激損傷評價的骨髓間充質干細胞培養方法。

背景技術

氧化應激(Oxidative stress,OxS)這個概念是在1985年首次提出的，OxS是指活性氧自由基形成與抗氧化防御機制之間的失衡，這種現象隨著年齡的增加，能夠影響骨骼組織的正常功能。另外，OxS學說指出，機體在受到不利刺激后活性氧含量會大幅提高，在超出機體清除能力范圍后則導致氧化系統與抗氧化系統之間失去平衡，過多的活性氧將會廣泛參與到機體多種調節效應之中，引起OxS反應。更為嚴重的是OxS反應能夠直接損傷DNA，導致其所具有的生物活性及生理功能下降甚至完全喪失。

簡單來說，OxS的具體發生過程是在線粒體通過呼吸鏈氧化磷酸化生成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的過程中,伴隨著呼吸鏈漏出的電子與氧分子(O2)在細胞色素P-450、單氧酶等酶的作用下生成超氧陰離子O2-，此為細胞內初級活性氧(reactiveoxygen species,ROS)，之后超氧陰離子進一步通過一系列酶促反應形成羥自由基(OH-)和過氧化氫(H2O2)等次級活性氧，此途徑是細胞內ROS產生的主要來源，同時其他酶系如還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶、環氧化酶、醛氧化酶等也會促進細胞內ROS的產生。正常情況下，細胞內的ROS作為次級信使，在調節信號通路、炎癥反應、組織修復、細胞的增殖凋亡等過程中發揮著重要作用。

ROS雖然參與機體眾多的生理活動，但為了防治產生過多的ROS，我們人體存在一抗氧化系統，主要由抗氧化酶體系和非酶類抗氧化體系組成。前者包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)，非酶類抗氧化物包括有抗壞血酸(維生素C)、維生素E、類黃酮、輔酶Q10、白蛋白等。隨著機體的衰老，細胞內線粒體功能及抗氧化防御功能下降，ROS的產生與抗氧化清除失衡，引起OxS，導致細胞中脂質、糖類、蛋白質、DNA等大分子物質發生空間結構的變性、斷裂，進而造成對細胞的氧化損傷。過量的ROS也增加了線粒體外膜的通透性，使促凋亡因子細胞色素C漏出，引起細胞凋亡。因此當年齡增長，骨組織中ROS就會增多，通過對細胞因子、酶活性以及信號通路的調節，影響核內基因的轉錄表達，促使BMSCs、成骨細胞、骨細胞的凋亡和破骨細胞的增殖分化，骨重建一旦失衡，形成以骨吸收為主的代謝性骨病，就會誘發OP的形成。

事實上，前文提到ROS可以發揮多種生理作用，如蛋白磷酸化、多種轉錄因子的激活、細胞凋亡、免疫和分化等過程都依賴于細胞內適當量的ROS生成和存在。而在機體內，正常情況下，ROS通過氧代謝產生，除此之外，紫外線、電離輻射、污染物及重金屬等環境因素，及藥物因素也會導致ROS產生的增加，而過量ROS的產生則會破壞細胞結構，導致細胞和組織間的平衡失調，從而導致細胞和組織的損傷，發生氧化應激。