[發(fā)明專利]Ash1p作為負調(diào)控因子在提高宿主細胞中蛋白表達中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210354723.6
• 申請日: 2022-04-06
• 公開（公告）號: CN114774461B
• 公開（公告）日: 2023-05-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姚冬生;林香娜;劉大嶺;謝春芳;丁偉秋
• 申請（專利權(quán)）人: 暨南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C07K14/395;C12N15/31;C12N15/113;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 劉宇峰

本發(fā)明涉及真核基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的應(yīng)用，特別是涉及一種組成型啟動子Pgap的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Ash1p在應(yīng)用。本發(fā)明公開了Ash1p作為負調(diào)控因子在提高宿主細胞中蛋白表達中的應(yīng)用，所述Ash1p的氨基酸序列是由核苷酸序列為SEQ?ID?NO:1的Ash1基因所編碼的；所述應(yīng)用為通過敲除Ash1基因從而提高宿主細胞中蛋白的表達。本發(fā)明所述的應(yīng)用能通過減少阻遏作用來增強畢赤酵母表達系統(tǒng)中組成型啟動子Pgap轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進而提高目的蛋白的表達效率和產(chǎn)量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物工程學(xué)領(lǐng)域，涉及真核基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的應(yīng)用，特別是涉及一種組成型啟動子Pgap的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Ash1p的應(yīng)用。

背景技術(shù)

啟動子是調(diào)控基因表達的最重要元件之一，P_AOX1啟動子(誘導(dǎo)型)和Pgap啟動子(組成型)是畢赤酵母外源蛋白表達中最具代表性的啟動子。

甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母表達系統(tǒng)是目前用于表達大多數(shù)異源蛋白常用的表達系統(tǒng)，然而并不是所有的外源蛋白均適合甲醇誘導(dǎo)表達而且甲醇在大規(guī)模生產(chǎn)時存在極大的安全隱患。相對甲醇誘導(dǎo)，組成型畢赤酵母表達系統(tǒng)表達異源蛋白時不使用甲醇誘導(dǎo)，但是大多數(shù)的組成型啟動子強度相對較弱，無法獲得較高的蛋白產(chǎn)量，致使其在應(yīng)用上受限制。

針對甲醇誘導(dǎo)的弊端，近年來對畢赤酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)化改造成為了研究熱點。在啟動子的改造研究上，目前主要是通過各種方法構(gòu)建新的啟動子文庫。其中，有不少研究通過在P_AOX1上刪除或插入順式作用元件、對5'UTR或核心啟動子區(qū)域進行點突變等來改造P_AOX1從而導(dǎo)致P_AOX1的激活，但是這些改造似乎不能很好地消除由高水平葡萄糖和甘油等替代碳源引起的抑制，且遠達不到工業(yè)應(yīng)用的水平。對于Pgap文庫的構(gòu)建，唯一的研究是Qin等通過易錯PCR進行隨機突變構(gòu)建GAP啟動子文庫，但是方法隨機，無法解釋Pgap的調(diào)控。隨著轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的應(yīng)用，啟動子開發(fā)工作得到很大的提升。關(guān)于調(diào)控和提高P_AOX1的表達強度相關(guān)研究已有很多報道，目前研究表明，甲醇可通過調(diào)控多個反式作用元件(主要集中于P_AOX1啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子或者碳源阻遏相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等)的活性或亞細胞定位，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控P_AOX1，從而影響甲醇代謝通路相關(guān)基因的表達。盡管如此，參與P_AOX1調(diào)控的機制復(fù)雜，部分碳源的去阻遏，在蛋白表達上并未能超越傳統(tǒng)的甲醇誘導(dǎo)。目前在啟動子調(diào)控的研究上主要集中于PAOX1，而對于探索Pgap的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究，目前只有Ozge?Ata等，通過有針對性地刪除或復(fù)制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(TFBS)，構(gòu)建啟動子變異體的高表達rhGH菌株，而在公開文獻中報道通過對Pgap啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的改進，來增強Pgap啟動子表達目的蛋白產(chǎn)量的報道幾乎是空白的。

根據(jù)文獻報道，Ash1p在釀酒酵母中定位于細胞核時，可以關(guān)閉HO基因的轉(zhuǎn)錄，影響釀酒酵母交配型的轉(zhuǎn)換，通過比對，在畢赤酵母中Ash1基因推定為PAS_chr1-1_0414(序列號為：NC_012963.1)，而目前尚未有報道Ash1p對于轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的是針對宿主細胞中異源蛋白表達存在的問題和不足，提供了一種調(diào)控宿主細胞中異源蛋白表達的轉(zhuǎn)錄因子Ash1p，能通過減少阻遏作用來增強畢赤酵母表達系統(tǒng)中組成型啟動子Pgap轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進而提高目的蛋白的表達效率和產(chǎn)量。

本發(fā)明的第一個方面，提供了Ash1p作為負調(diào)控因子在提高宿主細胞中蛋白表達中的應(yīng)用，所述Ash1p的氨基酸序列是由核苷酸序列為SEQ?ID?NO:1的Ash1基因所編碼的；所述應(yīng)用為通過敲除Ash1基因從而提高宿主細胞中蛋白的表達。

根據(jù)本發(fā)明所述的應(yīng)用，所述宿主細胞是選自：畢赤酵母、釀酒酵母、產(chǎn)甘油假絲酵母。

根據(jù)已有文獻報道，畢赤酵母、釀酒酵母、產(chǎn)甘油假絲酵母等均可以接受以Pgap為啟動子的酵母表達載體，用以表達異源蛋白，因此可作為本發(fā)明的宿主細胞。