[發明專利]一種黃酮醇3-O-葡萄糖苷生物合成相關的黃酮醇3-O-葡萄糖基轉移酶及其應用

在審

• 申請號: 202210340159.2
• 申請日: 2022-04-01
• 公開（公告）號: CN115109763A
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發明（設計）人: 李鮮;曹運琳;解林峰;郭妍;梅宇洋;張波;陳昆松
• 申請（專利權）人: 浙江大學山東（臨沂）現代農業研究院;浙江大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/60;C12R1/19
• 代理公司: 杭州堅果知識產權代理事務所(普通合伙) 33366
• 代理人: 張劍英

本發明提供了一種黃酮醇3?O?葡萄糖基轉移酶、表達載體和以及含有該表達載體的轉基因細胞系和宿主菌。本發明首次克隆并驗證了桃黃酮醇3?O?葡萄糖苷生物合成相關的PpUGT78T3基因的功能，實現了PpUGT78T3基因的異源活性表達，重組蛋白可以利用黃酮醇和UDP?葡萄糖，高效轉化成黃酮醇3?O?葡萄糖苷。本發明還提供了PpUGT78T3基因及其編碼蛋白、含有該PpUGT78T3核苷酸序列的表達載體以及含有該表達載體的轉基因細胞系和宿主菌在黃酮醇3?O?葡萄糖苷生物合成中的用途。本發明進一步提供了表達載體及含有表達載體的轉基因細胞系或宿主菌在黃酮醇3?O?葡萄糖苷生物合成中的用途。

技術領域

本發明屬于植物分子生物技術和基因工程領域，一種黃酮醇3-O-葡萄糖苷生物合成相關的黃酮醇3-O-葡萄糖基轉移酶及其應用。

背景技術

類黃酮是植物體內一種重要的次生代謝物，根據化學結構的差異，類黃酮可以被分為6大類：黃酮、黃烷酮、黃烷醇、黃酮醇、花色苷和異黃酮。近年來，大量研究報道了黃酮醇具有抗氧化、抗腫瘤、預防心血管疾病和消炎等醫藥學活性。黃酮醇苷元多達十余種，其中園藝產品中常見的苷元主要是槲皮素、山柰酚和楊梅素等。黃酮醇苷元理化性質不穩定，通常以糖苷衍生物形式存在于植物液泡中。黃酮醇糖基化主要由尿苷二磷酸(Uridinediphosphate，UDP)糖基依賴的轉移酶(UDP-glycosyltransferase，UGT)催化，將糖基從活化的供體分子轉移到受體分子，主要的糖基供體包括UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖和UDP-鼠李糖。糖基化是許多次生代謝產物合成反應的最后一步，同時可以改變黃酮醇苷元的親水性，增加其溶解度和化學穩定性，影響其生物活性，有助于其在細胞內和生物體內的儲存和轉運等。因此，開展黃酮醇生物合成UGT的研究，對于進一步解釋自然界類黃酮的多樣性及其豐富的生物學功能具有重要意義，也對保健品開發或具有醫藥學活性化合物挖掘的關鍵性指導。

桃(Prunus persica)是薔薇科桃屬果樹，因果實風味濃郁，富含類黃酮等具有生物活性的天然產物而受到人們的喜愛。黃酮醇是桃中重要的類黃酮組分，包括槲皮素、山奈酚及其糖苷如槲皮素3-O-葡萄糖苷和山奈酚3-O-葡萄糖苷等，主要存在于桃果皮和桃花中。由于糖苷化產物的潛在的藥用價值以及對植物生命活動調節的重要性，現在已受到人們的廣泛關注。糖苷化產物主要依靠黃酮醇糖基化獲得，此反應主要由糖基依賴的酶進行催化。截至目前，桃類黃酮醇3-O-葡萄糖苷的生物合成的關鍵酶仍未被鑒別。然而鑒別出桃黃酮醇糖苷生物合成的關鍵酶，對于闡明桃黃酮醇糖苷生物合成途徑具有重要意義，也可用于其他植物基于基因工程技術的黃酮醇組分改良，對提高食物中的黃酮醇含量，增加食物的保健功能，具有重要的商業化或工業化應用價值。

發明內容

本發明首次表征了桃PpUGT78T3基因在參與黃酮醇3-O-葡萄糖苷生物合成基因中的獨特作用。從桃組織中成功克隆PpUGT78T3基因，即PpUGT78T3的cDNA序列(參見SEQ IDNO.1所示序列)，通過PCR擴增此DNA片段，然后將次片段連接至T-easy載體上(參見實施例1和實施列2)，驗證成功后構建表達載體pET-32a(+)在原核細胞中首次表達了PpUGT78T3多肽或蛋白質，即黃酮醇3-O-葡萄糖基轉移酶(參見SEQ ID NO.2所示序列和實施例2)。進一步，本發明所述的黃酮醇3-O-葡萄糖基轉移酶是由所述的PpUGT78T3基因經原核細胞內的復制、轉錄和翻譯過程而來。所述的復制指的是細胞以所述PpUGT78T3基因的核苷酸為模板產生多個相同的基因的過程。PpUGT78T3所述的轉錄是指細胞以所述多個相同的PpUGT78T3基因的核苷酸為模板，根據核苷酸互補配對原則，以核糖核苷酸為原料，合成對應的PpUGT78T3基因mRNA的過程。所述的翻譯是指，細胞進一步以所述的PpUGT78T3基因mRNA為模板，以各種氨基酸為原料，合成出PpUGT78T3基因對應得多肽或蛋白質的過程。所述的PpUGT78T3基因的CDS序列如SEQ:NO.1所示，編碼序列全長為1362個核苷酸，可編碼一個含453個氨基酸的蛋白。其氨基酸序列如SEQ:NO.2所示，含有一個保守的PSPG-box結構域，在糖基轉移酶大家族中屬于GT1家族。