[發明專利]一種峰駝源噬菌體展示納米抗體的構建方法

有效

• 申請號: 202210340059.X
• 申請日: 2022-04-01
• 公開（公告）號: CN114716549B
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發明（設計）人: 錢文斌;葉倩;王世兵;陳潔;徐云飛
• 申請（專利權）人: 杭州榮谷生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C07K16/06;C12N15/63
• 代理公司: 上海九澤律師事務所 31337
• 代理人: 蔡佳杰

1.一種CD47納米抗體，其特征在于：所述CD47納米抗體為A1、C6、2D、2E和5H中的任意一種；

其中所述A1的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；

其中所述2D的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；

其中所述2E的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

其中所述C6的DNA序列如SEQ ID NO.4所示；

其中所述5H的DNA序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根據權利要求1所述的一種CD47納米抗體，其特征在于：所述CD47納米抗體的構建方法具體步驟為：

S1. 噬菌體文庫的構建；

S2. 噬菌體文庫淘篩；

S3. 噬菌體ELISA檢測；

S4.表達hCD47nb；

S5. 流式篩選出與PATU8988T高結合的hCD47nb。

3.根據權利要求2所述的一種CD47納米抗體，其特征在于：所述步驟S1中，噬菌體文庫的構建，包括以下步驟：

S11. 選用健康雙峰駝進行免疫，初次免疫前采血留作陰性血清；

S12. 初次免疫：

選用CD47抗原，使用抗原與完全弗氏佐劑混合，乳化后對駱駝進行皮下多點注射，為每只駱駝接種抗原；接種后，采集外周血，檢測其免疫反應；

S13. 第二次免疫：

將CD47抗原與完全弗氏佐劑混合，乳化后對駱駝進行皮下多點注射，為每只駱駝接種抗原；接種后，采集外周血，檢測其免疫反應；

S14. 第三、四、五次免疫：

重復步驟S13的操作3次，完成駱駝的第三、四、五次免疫反應，并在第五次免疫結束后，采集50mL外周血，檢測免疫反應；

S15. 通過化學發光的方式，采用駱駝VHH特異性二抗測定抗原免疫效價；

S16. 分離淋巴細胞：5次免疫結束后，采全血，使用percoll分離淋巴細胞，并采用TRIZOL裂解淋巴細胞并收集RNA并逆轉錄成cDNA，并采用巢式PCR的方法，將cDNA通過兩輪PCR擴增抗體重鏈可變區VHH基因片段；

S17. VHH片段轉入TG1感受態細胞：

將上述得到的VHH片段連接到pADL-23C噬菌體展示載體質粒，之后將VHH片段及pADL-23C載體連接酶連接，電轉化至TG1感受態細胞中，制備噬菌體文庫。

4.根據權利要求3所述的一種CD47納米抗體，其特征在于：所述步驟S12和S13中，完全弗氏佐劑與抗原的體積比為（0.8-1.2）:1。

5.根據權利要求2所述的一種CD47納米抗體，其特征在于：所述步驟S2中，噬菌體文庫淘篩，包括以下步驟：

S21. 將篩選抗原包被免疫管，4℃緩慢旋轉過夜，同時平行包被5%脫脂奶粉作對照；之后將夜包被的免疫管中的液體棄掉，加入PBS緩沖液室溫清洗免疫管2-3次，每次旋轉4-6min；

S22. 再次向免疫管內加入5%脫脂奶粉，室溫旋轉封閉2h，封閉結束后，將免疫管中液體丟棄，并加入PBS緩沖液室溫清洗免疫管2-3次，每次旋轉3-8min，加入PBS緩沖液，加入步驟S1制備的噬菌體文庫，室溫旋轉孵育1-1.5h；

S23. 將免疫管內液體棄掉，加入PBST緩沖液室溫清洗免疫管8-10次，盡量去除殘余液體，加入Gly-HCl 洗脫液，室溫旋轉洗脫8-10 min，之后加入Tris-HCl中和緩沖液中和，將免疫管中的溶液轉移至新的離心管中，得到第一輪篩選噬菌體洗脫液；

S24. 取第一輪噬菌體洗脫液侵染TG1菌株，在離心管中進行10⁵及10⁶兩個倍數梯度稀釋后培養；

S25 重復步驟S21-S24進行第二輪淘篩，并對淘篩后菌株進行培養。

6.根據權利要求5所述的一種CD47納米抗體，其特征在于：所述步驟S23中，所述PBST緩沖液為溶有質量分數0.1%的Tween20的PBS緩沖液。