[發明專利]一種腈水合酶重組蛋白的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 202210338268.0
• 申請日: 2022-04-01
• 公開（公告）號: CN114686507A
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: 梁長海;郭祎;王黎
• 申請（專利權）人: 大連理工大學;大連理工大學成都研究院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/62;C12N1/21;C12P13/02;C12R1/19
• 代理公司: 遼寧鴻文知識產權代理有限公司 21102
• 代理人: 隋秀文

本發明屬于綠色化學技術領域，提供了一種腈水合酶重組蛋白的構建方法及其應用。本發明在腈水合酶重組質粒中插入一種G蛋白B1免疫球蛋白結合結構域(GB1)基因和一段柔性肽基因，從而表達出一種新型腈水合酶重組蛋白。與改造前相比，極大地促進了腈水合酶的可溶性表達，并顯著提高了催化二腈類化合物轉化效率，為生物催化腈類化合物的工業化應用提供了新的理論依據。

技術領域

本發明屬于綠色化學技術領域，涉及一種通過融合蛋白提高腈水合酶催化二腈化合物生物轉化效率的方法。

背景技術

大腸桿菌是一種常見的革蘭氏陰性菌，通常，在實驗室中可獲取的大腸桿菌都具備清晰明確的遺傳背景和十分強的環境適應力，同時也具有很強的代謝、繁殖能力，可以短時、高效地表達通過基因工程手段導入的基因，并分泌人們所需的表達產物，因此常被用作為基因工程的宿主細菌。但在實際試驗、生產的過程中，除了產生所需的正常蛋白質產物外，大腸桿菌還會產生許多不溶性的蛋白即包涵體。包涵體是一種通常產生于大腸桿菌胞質中的極為緊密的蛋白聚集體。當使用大腸桿菌作為外源表達系統來表達外源重組蛋白時，如果蛋白的生成速率大于折疊速率，胞質中蛋白累積濃度過高，生成的肽鏈沒有足夠的時間折疊成為正確的天然形式，就會導致蛋白聚集形成包涵體并沉淀。根據外源重組蛋白種類、性質、表達速率和表達水平的不同，生成包涵體的產量也有所不同。同時，由于大腸桿菌中含有還原型谷胱甘肽，對重組蛋白二硫鍵的形成不利，更容易導致包涵體的形成。當外源重組蛋白大量形成包涵體時，將會失去原有的天然結構，從而導致其功能喪失。包涵體的產生大大影響了目的基因表達產物的產率，并造成了極大的浪費。近年來，相當多的研究致力于減少包涵體的產生，但是依然沒有得到完美的解決。

腈水合酶(EC4.2.1.84，Nitrile Hydratase,簡稱NHase)，是腈轉化酶中的一種酶，因其可以將腈類化合物催化轉化為具有高附加值的酰胺類化合物，近年來引起了人們廣泛的關注。利用腈水合酶生成的丙烯酰胺、煙酰胺等酰胺類化合物也被廣泛應用于化工、醫藥、農藥等領域。在眾多高附加值的酰胺類化合物之中，5-氰基戊酰胺是一種重要的的化工原料和農藥中間體，可用于合成除草劑唑啶草酮(azafenidin)和6-氨基己酰胺。唑啶草酮有良好的耐低溫和耐雨水沖刷效應，可在冬前氣溫降到很低時用藥，也可在降雨頻繁的春季搶在雨天間隙及時用藥，因其在土壤中的半衰期僅為幾個小時，故對下茬作物安全，是麥田春季化除的優良除草劑。6-氨基己酰胺是合成己內酰胺的重要中間體，己內酰胺是一種常用的有機化工原料。由于5-氰基戊酰胺作為己二腈轉化為己二酰二胺的中間反應物，在工業催化中難以合成，需要高溫高壓等嚴苛條件，不僅成本高也導致了更多污染物的排放；同時傳統工業催化選擇性差，反應伴隨著大量的副產物生成，相較之下腈水合酶作為生物催化劑，具備反應溫和高效、選擇性優異、綠色無污染的優勢，具有良好的應用前景。

目前已知的腈水合酶菌種主要包括紅球菌屬(Rhodococcus)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)等這些菌大多來源于工廠附近的污泥及廢水之中，其生長條件苛刻且難以篩選、不易培養，因此將其基因轉入基因工程菌內進行表達已成為人們當下熱門的研究方向之一。本發明在研究前期，發現了一種腈水合酶基因并制備了腈水合酶基因工程菌，發現其有顯著的區域選擇性。然而發現在使用大腸桿菌作為外源表達系統來表達外源重組腈水合酶蛋白時會產生大量不溶的包涵體，降低了腈水合酶的正確表達。

G蛋白B1免疫球蛋白結構域(GB1)，是所屬于G蛋白的一種小蛋白，由一個穩定的單一結構域組成，具有良好的折疊能力和穩定性。這種小蛋白沒有二硫化物和輔助因子，卻具有良好的高溫耐受性，序列簡約的特點，可以幫助重組蛋白正確折疊、促進部分蛋白可溶性表達的作用，但目前尚未發現該蛋白對于促進Fe型腈水合酶可溶性表達的相關報道。

發明內容

本發明提供了一種G蛋白B1免疫球蛋白結合結構域(GB1)在促進腈水合酶重組蛋白的可溶性表達和提高二腈化合物催化效率方面的應用。