[發明專利]基于雙色共定位的MDA-MB-231細胞外泌體檢測方法和應用

在審

• 申請號: 202210336339.3
• 申請日: 2022-03-31
• 公開（公告）號: CN114705663A
• 公開（公告）日: 2022-07-05
• 發明（設計）人: 宗慎飛;黃樂涵;孫騰霄;宗啟航;石曉琦
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/58;G01N33/574;G01N33/533
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 秦秋星

1.一種基于雙色共定位的MDA-MB-231細胞外泌體檢測方法，其特征在于，具體步驟如下：將經過差速離心獲得的MDA-MB-231外泌體固定在八孔板上，使用CM-DiI標記外泌體膜，同時使用FAM熒光基團的PD-L1核酸適配體特異性捕獲外泌體，進行CM-DiI和FAM雙色熒光共定位外泌體檢測，只有兩種熒光重合的位置才是外泌體，不重合的位置為非特異性結合位點。

2.權利要求1所述雙色共定位的MDA-MB-231細胞外泌體的制備方法，其特征在于，為避免TIRF空間分辨率的限制，需制備單分散的外泌體樣品，以便在單粒子水平進行熒光共定位分析，具體步驟如下：

(1)取一八孔板，將PEI加入八孔板中，反應后用PBS沖洗，洗去多余的PEI；

(2)將提取的外泌體溶液適當稀釋，加入到步驟(1)得到的底部帶正電聚合物的八孔板中，反應后通過靜電吸附的原理將外泌體固定到八孔板上，之后用PBS沖洗；

(3)將BSA加入到步驟(2)所得的八孔板上，進行多余電荷封閉，反應后用PBS沖洗；

(4)將CM-DiI細胞膜熒光探針加入到步驟(3)得到的八孔板中，反應后用PBS沖洗，即可得到膜染色的外泌體；

(5)將靶向PD-L1抗原的核酸適配體探針FAM-PD-L1滴加在步驟(4)得到的八孔板上，反應后用PBS沖洗干凈，即得到帶有兩種不同熒光分子的PD-L1高表達的外泌體的樣本，用于雙色共定位成像。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于：步驟(1)中PEI的質量濃度為1％。

4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于：步驟(2)中的外泌體使用超高速冷凍型離心機對MDA-MB-231腫瘤細胞的培養液進行提取得到的，外泌體提純后分散在PBS中。

5.根據權利要求2所述的制備方法基于雙色共定位的MDA-MB-231細胞外泌體檢測方法，其特征在于：步驟(3)中，BSA的質量濃度為1％(w/v)。

6.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于：步驟(4)中，核酸適配體探針FAM-PD-L1的濃度為1nM。

7.基于權利要求2-6任一所述的制備方法制得的雙色共定位的MDA-MB-231細胞外泌體進行雙色熒光共定位成像的方法在免疫檢測上的應用，其特征在于，具體步驟如下：將制得的樣品放于單分子定位顯微鏡下進行TIRF熒光成像，收集495-575nm和570-650nm之間的熒光信號進行雙色熒光共定位分析，同時能夠檢測到CM-DiI和FAM熒光信號的點才是有效的MDA-MB-231外泌體。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，TIRF熒光成像中激發光波長分別為488nm和561nm。