[發(fā)明專利]一種用于分離牛肌肉干細胞的肌肉組織提取方法及其應(yīng)用

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• 申請日: 2022-03-31
• 公開（公告）號: CN114525249A
• 公開（公告）日: 2022-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張瑞門;楊素芳;韋英明;梁菁媛;鄧彥飛;鄭自華;王樂怡;安強
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N15/113
• 代理公司: 北京卓勝佰達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 16026
• 代理人: 張串串

1.一種用于分離牛肌肉干細胞的肌肉組織提取方法，其特征在于，所述提取方法包括：(1)用70-80％酒精擦拭牛皮膚表面，然后采集牛背最長肌肌肉組織，立即放入35-38℃的磷酸鹽緩沖液中漂洗至少一次，每次25-30s，并置于35-38℃的磷酸鹽緩沖液浸潤；(2)將所述牛背最長肌肌肉組織表面筋膜、白膜剔除干凈；(3)其次將所述牛背最長肌肌肉組織使用三蒸水中漂洗至少一次，再置于磷酸鹽緩沖液中漂洗至少一次，接著在70-80％酒精中漂洗15-20s，接著在磷酸鹽緩沖液中漂洗至少一次得所述牛肌肉組織。

2.一種分離牛肌肉干細胞的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)按照權(quán)利要求1所述的肌肉組織提取方法提取牛肌肉組織，然后切成碎粒，再用35-38℃的磷酸鹽緩沖液重懸、洗滌碎粒組織血絲，37℃恒溫靜置5min，去上清；(b)將所述切碎的牛肌肉組織制備成牛肌肉組織消化液；(c)將所述牛肌肉組織消化液分別使用70μm，40μm過濾器過濾組織液，離心收集細胞沉淀，并加入37℃磷酸鹽緩沖液洗滌細胞以致進一步除去血絲，再次離心收集細胞沉淀得原代牛肌肉干細胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述牛背最長肌肌肉組織來自胎牛。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述胎牛為3-4月齡胎牛。

5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，步驟(b)中，將所述切碎的牛肌肉組織制備成牛肌肉組織消化液，分成兩步法進行：第一步，在膠原酶溶液中添加中性酶Ⅱ，37℃、無菌搖床環(huán)境搖動消化；第二步，棄除膠原酶溶液，加入0.25％胰酶溶液，重懸混勻，37℃、無菌搖床環(huán)境搖動消化。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，將所述原代牛肌肉干細胞進行原代培養(yǎng)，包括：

將所述原代牛肌肉干細胞混勻、靜置2h，再將上層細胞液繼續(xù)培養(yǎng)，靜置1-1.5h，再轉(zhuǎn)移上層細胞液繼續(xù)培養(yǎng)；在兩次培養(yǎng)過程中，使用原代培養(yǎng)基，所述原代培養(yǎng)基包括：糖分含量為0.5-1.5g/L DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，19-21nM兩性霉素,0.62-0.63mg/mL慶大霉素，95-105μl/mL青鏈霉素，胎牛血清，其體積比為39-40mL：0.1-1：0.1-1：0.1-1：9-11。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，在所述原代培養(yǎng)后進行傳代培養(yǎng)，包括：使用牛肌肉干細胞普通培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，所述牛肌肉干細胞普通培養(yǎng)基包括：含量為0.5-1.5g/L DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，95-105μl/mL青鏈霉素，胎牛血清，其體積比為：44-45：0.1-1：4-6。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，將所述傳代培養(yǎng)結(jié)束后的牛肌肉干細胞使用磷酸鹽緩沖液洗滌，然后使用成肌分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)誘導(dǎo)所述牛肌肉干細胞成肌；所述成肌分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括：糖分含量0.5-1.5g/L的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，95-105μl/mL青鏈霉素，馬血清，其體積比為48-49:0.1-1：0.5-1.5。

9.一種牛肌肉干細胞超級增強子的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括：(I)根據(jù)權(quán)利要求2-8任一所述的方法獲得所述牛肌肉干細胞；(II)對所述肌肉干細胞進行染色質(zhì)免疫共沉淀高通量測序，獲得全基因組中不同染色體上構(gòu)成增強子標記；(III)依次使用H3K4me1 BED文件和H3K27ac BAM文件的ROSE算法進行肌肉干細胞超級增強子鑒定，并對12.5kb范圍內(nèi)的H3K4me1結(jié)合峰進行縫合，獲得構(gòu)成增強子，之后通過H3K27ac BAM文件計算每個構(gòu)成增強子內(nèi)的信號值，并基于H3K27ac信號值對構(gòu)成增強子進行排序，獲得所述牛肌肉干細胞超級增強子。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述染色質(zhì)免疫共沉淀高通量測序的數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，綜合reads讀數(shù)數(shù)量、NSC值、RSC值及NRF值進行評價；選擇TSS及前后2K區(qū)域內(nèi)存在reads讀數(shù)；NSC1.10，RSC1.0；NRF0.7的數(shù)據(jù)。