[發明專利]一種定量分析赤潮暴發早期單細胞球形棕囊藻的方法

在審

• 申請號: 202210331826.0
• 申請日: 2022-03-31
• 公開（公告）號: CN114574623A
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發明（設計）人: 王佳樂;王英輝;賴俊翔;李杰;許銘本;陸家昌
• 申請（專利權）人: 廣西科學院;廣西大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/89
• 代理公司: 南寧智卓專利代理事務所(普通合伙) 45129
• 代理人: 蘇惠

本發明公開了一種定量分析赤潮暴發早期單細胞球形棕囊藻的方法，包括引物和探針的設計與合成，樣品基因DNA提取，采用引物和探針配置熒光定量PCR定量體系以及構建定量標準曲線，并進行熒光定量PCR檢測。將提取的核酸溶液所測得的Ct值帶入定量標曲方程式，即可對單細胞球形棕囊藻定量。本發明提供定量分析赤潮暴發早期單細胞球形棕囊藻的方法，最低定量限可達到32個單細胞，并且定量分析了實際環境樣本中較低豐度的單細胞球形棕囊藻，能準確實現球形棕囊藻赤潮暴發早期低豐度的單細胞棕囊藻定量分析。

技術領域

本發明涉及分子生物學方法檢測環境微生物技術領域，特別涉及一種定量分析赤潮暴發早期單細胞球形棕囊藻定量方法。

背景技術

球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)屬于金藻門定鞭藻綱(Haptophyceae)，是全球范圍普遍存在的一類有害赤潮種。在赤潮暴發早期為游離的單細胞(3-8μm)，赤潮暴發時大量單細胞聚集形成囊體從而暴發赤潮。棕囊藻囊赤潮的暴發嚴重危害養殖業、生態旅游業，造成巨大的經濟損失，爆發球形棕囊藻赤潮還易于導致核電站冷卻水系統堵塞，嚴重威脅到核電和公眾的安全。因此，應給與球形棕囊藻高度重視，急需加強對球形棕囊藻赤潮藻的監測、預警和治理研究。

然而在赤潮暴發早期，針對單細胞球形棕囊藻的定量分析技術一直是國內外尚未解決的難題。目前常用的監測手段比如顯微鏡技術、流式技術以及衛星遙感技術靈敏度不夠。大多在囊體赤潮暴發后才有所察覺，而此時才采取相應的治理措施卻為時已晚，所以，如果在赤潮暴發之前能夠快速監測赤潮發生早期的赤潮藻類的動態，然后采取相應的預防、消除措施，這將有效的避免極大的經濟損失以及保障人類的生命健康安全，具有非常重大的實際意義。既然要提前了解赤潮種類動態，只做到對赤潮種的定性檢測遠遠不夠，還需要對其進行準確的定量。因此尋找赤潮暴發早期單細胞球形棕囊藻的定量分析方法成了當務之急。

發明內容

本發明的目的在于：針對上述存在的問題，提供定量分析赤潮暴發早期單細胞球形棕囊藻的試劑盒，并實現球形棕囊藻赤潮暴發早期低豐度的單細胞棕囊藻定量分析。

為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

一種定量分析赤潮暴發早期單細胞球形棕囊藻的方法，包括以下操作步驟：

(1)引物和探針的設計與合成：

在球形棕囊藻核糖體基因5.8S-ITS2區域的保守區域設計與合成引物和探針，設計與合成引物序列為：

上游引物序列PGf2：5'-ATGGCATTTCCAAGTTTCGC-3'，退火溫度58.6℃；

下游引物序列PGr2：5'-GCACTCCCCAGCTTCAGC-3'，退火溫度58.1℃；

TaqMan探針的序列PGp2：5'-FAM-CGTCTGAACCTCCTCCA-NFQ-MGB-3'，退火溫度68℃；

(2)樣品基因DNA提取：采用天根植物基因組DNA提取試劑盒進行提取，提取出樣品基因的核酸溶液；

(3)采用步驟(1)中的引物和探針配置熒光定量PCR定量體系，并進行熒光定量PCR檢測；

(4)采用步驟(2)提取的實際環境樣本的核酸溶液與球形棕囊藻陽性對照樣品的熒光定量PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳和測序比對分析，以確定方法的特異性以及對實際環境樣本中單細胞球形棕囊藻定量的可行性；

(5)單細胞球形棕囊藻定量：取待測樣品通過流式細胞儀準確計數，之后按步驟(2)提取核酸溶液，稀釋后按步驟(3)對各數量級的樣品進行定量體系的配置和上機檢測，其中擴增曲線的閾值設定在擴增曲線的指數期，所設置的閾值＝0.105，閾值與擴增曲線相交時的值為Ct值，根據各個數量級的細胞和其所測得的Ct值之間的關系建立標準曲線，得到定量方程式，以此方程式計算出球形棕囊藻單細胞的數量。