[發(fā)明專利]特異性抗煙草PVY病毒的dsRNA及其體外合成引物和抗病性的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210331791.0
• 申請日: 2022-03-31
• 公開（公告）號: CN114736899A
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許汝冰;李錫宏;黎妍妍
• 申請（專利權(quán)）人: 湖北省煙草科學(xué)研究院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/11;C12N15/10;A01N63/60;A01P1/00
• 代理公司: 南京縱橫知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32224
• 代理人: 徐瑛

1.一種特異性抗煙草PVY病毒的dsRNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一種體外合成權(quán)利要求1所述的特異性抗煙草PVY病毒的dsRNA的引物對，其特征在于，

正向引物PCP-F的核苷酸序列為：5’-GCAAATGACACAATCGATGC-3’，

反向引物PCP-P的核苷酸序列為：5’-TTGCCTAAGGGTTGGTTTTG-3’。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物對，其特征在于，在所述正向引物和反向引物的5’端還均添加了T7啟動子序列；

添加了T7啟動子序列的正向引物PCP-T7F的核苷酸序列為：5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGCAAATGACACAATCGATGC-3’；

添加了T7啟動子序列的反向引物PCP-T7P的核苷酸序列為：5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTTGCCTAAGGGTTGGTTTTG-3’。

4.權(quán)利要求1所述的特異性抗煙草PVY病毒的dsRNA的體外合成方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、從感染PVY病毒的煙株葉片中提取煙草PVY病毒的總RNA，以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得病毒樣本的cDNA；

S2、以步驟S1所得cDNA為模板進行PCR擴增，純化回收目的片段；

S3、將純化回收的目的片段連接至載體上，再將載體加入感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)擴增，挑取陽性克隆的CP蛋白，對CP蛋白進行測序，獲得如SEQ ID NO.2所示的表達CP蛋白的PVY病毒靶基因序列；

S4、比對PVY病毒靶基因序列和已有PVY病毒靶基因序列，選取保守性較高區(qū)域的核苷酸序列；轉(zhuǎn)錄合成靶序列的正義鏈和反義鏈ssRNA，混合、退火得到dsRNA。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的體外合成方法，其特征在于，步驟S2中PCR擴增的反應(yīng)體系為：5μL含MgCl₂的10×PCR Buffer，1μL 10μmol/L dNTPs，10μmol/L的正反向引物各1μL，cDNA2μL，4U Taq DNA聚合酶，加滅菌ddH₂O至50μL；

反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，循環(huán)30次后72℃延伸10min。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的體外合成方法，其特征在于，步驟S3具體為：將目的片段連接至pMD-19T載體上，16℃反應(yīng)4h；然后將連接產(chǎn)物加至DH5α感受態(tài)細胞中，冰上孵育30min，然后42℃熱激轉(zhuǎn)化90s，再加入LB液體培養(yǎng)基，37℃，200rpm搖菌2h；吸取菌液至含Amp⁺濃度為100mg/mL的LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜；挑取陽性克隆，進行測序獲得表達CP蛋白的PVY病毒靶基因序列。

7.一種權(quán)利要求1所述的特異性抗煙草PVY病毒的dsRNA在防治煙草PVY病毒中的應(yīng)用。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，取所述特異性抗煙草PVY病毒的dsRNA，使用用于PVY病毒接種的緩沖液配置成混合液，噴施或涂抹在煙草葉片上。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，使用所述特異性抗煙草PVY病毒的dsRNA配制的混合液時，噴施或涂抹的用量以dsRNA計為每片煙葉20μg。