[發(fā)明專利]酶活提高的精氨酸脫亞胺酶突變體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210329069.3
• 申請日: 2022-03-30
• 公開（公告）號: CN114621944B
• 公開（公告）日: 2023-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張濤;王文玉;江波;高巍
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/04;A61K38/50;A61P35/00;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發(fā)明公開了酶活提高的精氨酸脫亞胺酶突變體，屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用定點(diǎn)突變技術(shù)對野生型精氨酸脫亞胺酶arcA編碼基因進(jìn)行分子改造，得到了一系列突變體酶ADIsupgt;N116G/supgt;、ADIsupgt;T203G/supgt;、ADIsupgt;A103Y/supgt;、ADIsupgt;T32Y/supgt;、ADIsupgt;G345A/supgt;，相對于野生型精氨酸脫亞胺酶氨基酸序列的第116位天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼幔?03位蘇氨酸突變?yōu)楦拾彼幔?03位丙氨酸突變?yōu)槔野彼幔?2位蘇氨酸突變?yōu)槔野彼幔?45位甘氨酸突變?yōu)楸彼帷１景l(fā)明所述的定點(diǎn)突變改造的精氨酸脫亞胺酶正向突變體與野生酶相比其酶活力提高了1.47?2.11倍，解決了精氨酸脫亞胺酶催化能力低的問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶活提高的精氨酸脫亞胺酶突變體，屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

精氨酸脫亞胺酶(Arginine?deiminase，EC?3.5.3.6)簡稱ADI，它能將精氨酸水解，生成瓜氨酸和氨，因此可用于瓜氨酸的生產(chǎn)。精氨酸脫亞胺酶的微生物來源十分廣泛，從1933年被首次發(fā)現(xiàn)以來，已在乳鏈球菌、糞鏈球菌、酵母、假單胞菌、支原體、鹽桿菌及部分真核細(xì)胞等中發(fā)現(xiàn)有該酶存在。不同微生物來源的ADI分子量范圍，最適pH、最適溫度等酶學(xué)性質(zhì)具有明顯的差異。

目前，ADI主要被研究用于瓜氨酸的生產(chǎn)，具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化效率高、提取工藝簡單等優(yōu)點(diǎn)，具有較高的研究和生產(chǎn)價(jià)值。然而，目前已被報(bào)道發(fā)現(xiàn)的大部分ADI都表現(xiàn)出低比酶活力，這成為ADI產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的技術(shù)瓶頸。因此，尋找催化效率更高、安全穩(wěn)定的精氨酸脫亞胺酶成為該酶用于功能性食品配料生物制造的關(guān)鍵問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了經(jīng)定點(diǎn)突變改造的精氨酸脫亞胺酶突變體，以奧氏嗜熱鹽絲菌(Halothermothrix?orenii)的精氨酸脫亞胺酶基因登錄號：NC_011899.1:720621-721853，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得。

在一種實(shí)施方式中，所述突變體是將出發(fā)酶的第116位天冬氨酸，第203位蘇氨酸，第103位丙氨酸，第32位蘇氨酸或第345位甘氨酸進(jìn)行了突變。

在一種實(shí)施方式中，所述突變體是將出發(fā)酶的第116位天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼幔@得突變體N116G，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

在一種實(shí)施方式中，所述突變體是將出發(fā)酶的第203位蘇氨酸突變?yōu)楦拾彼幔@得突變體T203G，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

在一種實(shí)施方式中，所述突變體是將出發(fā)酶的第103位丙氨酸突變?yōu)槔野彼幔@得突變體A103Y，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

在一種實(shí)施方式中，所述突變體是將出發(fā)酶的第32位蘇氨酸突變?yōu)槔野彼幔@得突變體T32Y，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.5所示。

在一種實(shí)施方式中，所述突變體是將出發(fā)酶的第345位甘氨酸突變?yōu)楸彼幔@得突變體G345A，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.6所示。

本發(fā)明還提供了編碼所述突變體的基因。

在一種實(shí)施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7～11所示。

本發(fā)明還提供了攜帶所述基因的重組質(zhì)粒。

在一種實(shí)施方式中，所述重組質(zhì)粒包括但不限于pET系列質(zhì)粒。

本發(fā)明還提供了表達(dá)所述突變體的重組微生物細(xì)胞。

在一種實(shí)施方式中，所述重組微生物細(xì)胞包括但不限于細(xì)菌或真菌。

在一種實(shí)施方式中，所述微生物為大腸桿菌。