[發(fā)明專利]快速檢測百香果黃瓜花葉病毒的試劑盒及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210329056.6
• 申請日: 2022-03-30
• 公開（公告）號: CN114941040A
• 公開（公告）日: 2022-08-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李康;王玉慧;郭志宇;李名揚;王瑞
• 申請（專利權(quán)）人: 海南大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 蘇州中合知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32266
• 代理人: 劉召民

1.快速檢測百香果黃瓜花葉病毒的試劑盒，包括CMV引物，所述CMV引物的序列為：

CMV-F 5′-cggtattgaacgctgcgttattcacgctgg-3′，

CMV-R 5′-ctaggataaccttgaattgctccatccacgc-3′。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測百香果黃瓜花葉病毒的試劑盒，其特征在于，還包括CMV探針，所述CMV探針的序列不與特異性引物識別位點重疊，長度為46-52nt，序列避免回文序列、內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基；所述CMV探針共有四個修飾位點：距離5′端的≥35nt的中部位置標(biāo)記一個dSpacer THF，作為核酸外切酶的識別位點；THF位點的上游標(biāo)記一個熒光基團，下游標(biāo)記一個淬滅基團，兩個基團的間距為2-4nt；THF距離3′末端≥15nt，并且3′末端標(biāo)記一個修飾基團。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測百香果黃瓜花葉病毒的試劑盒，其特征在于，所述修飾基團選自胺基、磷酸基團或C3-Spacer。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的快速檢測百香果黃瓜花葉病毒的試劑盒，其特征在于，所述CMV探針的序列為tacctgggatgtgcccacccgaac[FAM-dT]c[THF][BHQ1-dT]tcgacattgtattt[C3-spacer]。

5.快速檢測百香果黃瓜花葉病毒的方法，包括：

1)向反應(yīng)管中加入上游引物、下游引物、探針、RNase-free水、核酸模板和緩沖液；

上游引物的序列為：5′-cggtattgaacgctgcgttattcacgctgg-3′，

下游引物的序列為：5′-ctaggataaccttgaattgctccatccacgc-3′，

探針序列為：

tacctgggatgtgcccacccgaac[FAM-dT]c[THF][BHQ1-dT]tcgacattgtattt[C3-spacer]；

2)混勻后，將反應(yīng)液甩至管子底部，然后立即將反應(yīng)管放入恒溫設(shè)備中，恒溫42℃，反應(yīng)時間30min；

3)將反應(yīng)后的產(chǎn)物至于熒光檢測儀中，在陰性對照呈現(xiàn)無熒光，陽性對照呈現(xiàn)熒光的情況下，若樣品呈現(xiàn)熒光，說明此樣品存在CMV病毒的感染；若樣品無熒光，說明此樣品不存在CMV病毒的感染。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速檢測百香果黃瓜花葉病毒的方法，其特征在于，步驟1)中通過以下方法獲取核酸模板：取5-10g百香果新鮮的嫩葉置于1.5mL的離心管中，加入15-25μL RNase free水，用研磨棒將其研磨至勻漿狀，吸取2μL至新的離心管中并稀釋至50μL作為核酸模板使用。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速檢測百香果黃瓜花葉病毒的方法，其特征在于，步驟1)每10μL反應(yīng)體系中，加入0.4μL上游引物、0.4μL下游引物、0.24μL探針、2.08μL RNase-free水、0.5μL核酸模板和6.38μL緩沖液。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速檢測百香果黃瓜花葉病毒的方法，其特征在于，步驟1)中引物和探針濃度分別為10μM和5μM。

9.根據(jù)權(quán)利要求5-8任意一項所述的快速檢測百香果黃瓜花葉病毒的方法，其特征在于，步驟3)中陰性對照的模板為RNase-free水，陽性對照的模板為CMV質(zhì)粒。