[發(fā)明專利]一種提高釀酒酵母DNA片段轉化效率的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202210322772.1
• 申請日: 2022-03-30
• 公開（公告）號: CN114807209A
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發(fā)明（設計）人: 杜軍;謝天;盧修亮;李濤;岳方正;王文朋;王早霞
• 申請（專利權）人: 北京擎科生物科技有限公司;國家林業(yè)和草原局生物災害防控中心
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/10
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

1.一種提高釀酒酵母DNA片段轉化效率的方法，其特征在于，具體如下：

(1)合成目的DNA片段：將0.1-100kb的DNA片段，或20kb-1Mb待合成的大分子片段分級拆分成若干0.1-100kb的片段，進行合成；

(2)將步驟(1)的DNA片段或拆分后的片段進行甲基化修飾；

(3)將經過甲基化修飾的DNA片段、或將經過甲基化修飾的拆分后DNA片段，以及線性化的質粒共同轉化入酵母細胞進行組裝或轉化。

2.如權利要求1所述的一種提高釀酒酵母DNA片段轉化效率的方法，其特征在于，所述DNA片段可以是線性化DNA，也可以是環(huán)化的質粒DNA。

3.如權利要求1所述的一種提高釀酒酵母DNA片段轉化效率的方法，其特征在于，所述甲基化修飾是通過甲基轉移酶處理獲得，所述甲基轉移酶可以是以下甲基轉移酶中的至少一種：CpG甲基轉移酶、GpC甲基轉移酶、dam甲基轉移酶、dcm甲基轉移酶，EcoRI甲基轉移酶、HpaII甲基轉移酶、MspI甲基轉移酶、HhaI甲基轉移酶、Taq I甲基轉移酶、AluI甲基轉移酶、BamHI甲基轉移酶、HaeIII甲基轉移酶、DpnM甲基轉移酶、人DNA甲基轉移酶、EcoGII甲基轉移酶等具有甲基化修飾DNA的酶。

4.如權利要求3所述的一種提高釀酒酵母DNA片段轉化效率的方法，其特征在于，所述甲基化酶由CpG甲基轉移酶、GpC甲基轉移酶、Taq I甲基轉移酶、DpnM甲基轉移酶中的2種酶組合或3種酶組合或4種酶組合。

5.如權利要求4所述的一種提高釀酒酵母DNA片段轉化效率的方法，其特征在于，所述甲基化酶由CpG甲基轉移酶、GpC甲基轉移酶、Taq I甲基轉移酶、DpnM甲基轉移酶按酶活4:3:1:2的比例進行組合。

6.如權利要求1所述的一種提高釀酒酵母DNA片段轉化效率的方法，其特征在于，甲基化修飾的50μL反應體系如下：加入2-5μgDNA片段與1-10U甲基轉移酶混合，加入終濃度80～160μM的S-腺苷甲硫氨酸，5μL 10×的反應緩沖液，ddH₂O補足到50μL，37-65℃水浴反應1-5h。

7.如權利要求1所述的一種提高釀酒酵母DNA片段轉化效率的方法，其特征在于，所述DNA片段設計有連接質粒的同源臂，拆分片段之間設置有能夠順序連成全長片段的同源臂。

8.如權利要求1所述的一種提高釀酒酵母DNA片段轉化效率的方法，其特征在于，所述質粒可以是任意一種酵母載體或酵母、大腸桿菌穿梭載體，包括但不限于pGADT7、pGBKT7、pRS415、pPICZC、pYX212。

9.如權利要求1所述的一種提高釀酒酵母DNA片段轉化效率的方法，其特征在于，所述轉化方法包括但不限于PEG-LiAc法、電轉化法。