[發(fā)明專利]一種褐藻膠裂解酶ALyI1及其應用

在審

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• 申請日: 2022-03-29
• 公開（公告）號: CN114752586A
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發(fā)明（設計）人: 周燕霞;張銘靜;贠帥婷;彭力陽;馬雨
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N1/21;C12N15/70;A61K38/51;A61P31/04;A01N63/50;A01P1/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京秉文同創(chuàng)知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11859
• 代理人: 陳少麗;張文武

本發(fā)明從海參腸細菌Tamlanasp.中克隆的褐藻膠裂解酶ALYI1(32.15kDa)。ALYI1，屬于多糖裂解酶7家族，該酶在40℃、pH 8.6條件下活性最佳，表現(xiàn)出顯著的耐鹽性，在0.0–5.0M NaCl之間保持穩(wěn)定，并對銅綠假單胞菌具有抗生物膜作用，可以作為去除或抑制銅綠假單胞菌生物膜形成的一種方法。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，尤其涉及一種褐藻膠裂解酶及其應用。

背景技術

綠膿桿菌是一種革蘭氏陰性細菌，可引起植物和動物的機會性感染。除了在住院患者中引起醫(yī)院獲得性肺炎和呼吸機相關性肺炎外，銅綠假單胞菌在呼吸系統(tǒng)受損的囊性纖維化患者中尤其嚴重。由于銅綠假單胞菌精細的適應機制，包括生物膜形成、對抗生素產(chǎn)生的抗性、基因組可塑性、超突變性以及在感染的不同階段產(chǎn)生各種毒性階段，因此在感染后從囊性纖維化患者的肺中根除銅綠假單胞菌非常困難。銅綠假單胞菌的生物膜包含胞外多糖、Pel、Psl和褐藻膠。Pel由N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰氨基葡萄糖組成。Psl由半乳糖和甘露糖組成。

褐藻膠是一種線性酸性多糖，是褐藻(如褐藻科)細胞壁和細胞內(nèi)物質(zhì)的重要組成部分。在結構上，它由α-L-古洛糖醛酸鹽(G)和β-D-甘露糖醛酸鹽(M)組成，通過1，4-糖苷鍵連接，這兩種糖單元可以按照三種模式進行組合:聚古洛糖醛酸(polyG)、聚甘露糖醛酸(polyM)和雜聚物嵌段(poly MG)。

褐藻膠裂解酶具有多種來源，包括海洋和陸地細菌、真菌、病毒、褐藻、海洋軟體動物和棘皮動物。在過去的幾年里，已經(jīng)鑒定了許多來自細菌的褐藻膠裂解酶。根據(jù)碳水化合物活性酶(CAZy)數(shù)據(jù)庫，已對14個多糖裂解酶(PL)家族(PL5、6、7、8、14、15、17、18、31、32、34、36、39和41)進行了分類，最大的褐藻膠裂解酶家族為PL7家族。

褐藻膠裂解酶是通過β-消除反應降解褐藻膠，產(chǎn)生不飽和產(chǎn)物的酶。按催化方式進行分類，褐藻膠裂解酶可分為內(nèi)切型和外切型。褐藻膠裂解酶可用于研究褐藻膠的精細結構，生產(chǎn)特定長度的polyM和polyG嵌段或褐藻膠寡糖，用于農(nóng)業(yè)、生物技術和醫(yī)學工業(yè)中的特定應用，以及生產(chǎn)用于生物燃料生產(chǎn)的單糖。褐藻膠裂解酶也被探索作為囊性纖維化的生物治療劑，因為它們可以通過清除生物膜基質(zhì)中的褐藻膠來增加抗生素的效率。

本研究從海洋細菌Tamlanasp.I1中分離純化了一種新的褐藻膠裂解酶。報道了其相關生化特性和對銅綠假單胞菌生物膜的作用能力。該酶具有良好的耐鹽性。

發(fā)明內(nèi)容

一方面，本發(fā)明提供了一種褐藻膠裂解酶，所述褐藻膠裂解酶的氨基酸序列與SEQIDNo.2相比，具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

在一個實施方式中，所述褐藻膠裂解酶來源于海洋細菌Tamlanasp.，例如，海洋細菌Tamlanasp.I1。

在一個實施方式中，所述褐藻膠裂解酶的氨基酸序列與SEQIDNo.2相比具有至少99％的序列同一性，并且來源于海洋細菌Tamlanasp.I1。

在優(yōu)選的實施方式中，所述褐藻膠裂解酶的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。

另一方面，本發(fā)明還提供了褐藻膠裂解酶的編碼基因，優(yōu)選的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

另一方面，本發(fā)明還提供了包含上述編碼基因的重組載體，所述重組載體優(yōu)選為重組表達載體，如pET系列的載體，例如pET-22b；又如，pRSFDuet-1載體。

另一方面，本發(fā)明還提供了包含上述重組載體的重組菌株，優(yōu)選的，所述重組菌株為大腸桿菌，如，大腸桿菌BL21。

另一方面，本發(fā)明還提供了上述褐藻膠裂解酶、基因、載體或菌株在降解褐藻膠中的應用。

在一個實施方式中，所述褐藻膠包括海藻酸鈉。