[發(fā)明專利]以G-四鏈體為猝滅基團于核酸適配體檢測生物小分子的熒光檢測試劑盒、使用方法及應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2022-03-29
• 公開（公告）號: CN114674747A
• 公開（公告）日: 2022-06-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊成;初小琳;崔勝楠;王越;金波;孫冰冰
• 申請（專利權(quán)）人: 大連理工大學(xué)
• 主分類號: G01N21/01
• 分類號: G01N21/01;G01N21/64
• 代理公司: 大連理工大學(xué)專利中心 21200
• 代理人: 李曉亮

本發(fā)明涉及一種以G?四鏈體為猝滅基團于核酸適配體檢測生物小分子的熒光檢測試劑盒、使用方法及應(yīng)用，屬于生化分析技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明基于G?四鏈體對熒光染料具有較強猝滅作用的特性，利用靶標分子誘導(dǎo)富含G的核酸適配體形成G?四鏈體等二級結(jié)構(gòu)，且所形成G?四鏈體等二級結(jié)構(gòu)的量與靶標分子的濃度相關(guān)，從而以G?四鏈體作為免標記的猝滅基團用于檢測生物小分子。同時，核酸適配體的兩端延長可形成互補堿基對的尾鏈，用于嵌入非標記熒光染料，并通過增加互補堿基的對數(shù)實現(xiàn)熒光信號的增大。本發(fā)明無需對核酸適配體進行標記，制作成本低，檢測成本低，且檢測原理簡單，操作簡便，降低了對操作人員的要求，更利于實際應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生化分析技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及了一種以G-四鏈體為猝滅基團于核酸適配體檢測生物小分子的熒光檢測試劑盒。

背景技術(shù)

公開該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

核酸作為細胞遺傳信息的存儲介質(zhì)在生物系統(tǒng)中起到重要作用。在過去的幾十年里，科學(xué)家們利用核酸的特殊結(jié)構(gòu)和它的識別能力實現(xiàn)了各種科學(xué)研究或技術(shù)應(yīng)用。其中，核酸的一個新興的應(yīng)用是開發(fā)核酸適配體(Aptamer)，核酸適配體最初是在20世紀90年代通過指數(shù)富集過程(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)系統(tǒng)配體進化而發(fā)現(xiàn)的。核酸適配體是能夠和各種靶標物進行高親和力、高特異性識別的單鏈DNA或RNA。由于核酸適配體良好的選擇性和對靶標物的高親和力，這使得它們在檢測應(yīng)用方面比傳統(tǒng)的識別單元更加有優(yōu)勢，甚至可優(yōu)于蛋白質(zhì)抗體。因為它們通常在各種環(huán)境條件下更穩(wěn)定，可重復(fù)使用，而且合成成本低，在合成和修飾上更簡單。因此，核酸適配體可以替代傳統(tǒng)抗體在基礎(chǔ)研究、藥物檢測、臨床診斷和各種疾病治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

G-四鏈體是最重要的非經(jīng)典核酸二級結(jié)構(gòu)之一，因為它們具有高度的穩(wěn)定性和廣泛的分布。G-四鏈體是由富含鳥嘌呤的寡核苷酸形成的特殊核酸二級結(jié)構(gòu)。G-四鏈體的核心單元是G-四重體，由四個鳥嘌呤堿基通過Hoogsteen氫鍵連接而成。兩個或多個鳥嘌呤四重體的堆疊形成G-四鏈體。與常以雙螺旋結(jié)構(gòu)存在的DNA雙鏈不同，根據(jù)構(gòu)成結(jié)構(gòu)的寡核苷酸的序列以及核酸鏈的走向不同，G-四鏈體可以形成不同的拓撲結(jié)構(gòu)。因其序列設(shè)計和結(jié)構(gòu)靈活多變，G-四鏈體已經(jīng)成為一種高靈敏度分析檢測的重要單元。

熒光檢測方法因其高靈敏度、簡單的操作、檢測所需時間短，在快速靈敏分析中展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢。現(xiàn)有技術(shù)有利于核酸適配體對生物小分子進行定量檢測，但是需要對適配體進行標記，即在適配體的核苷酸上修飾熒光基團或猝滅基團。雖然修飾的熒光基團具有更穩(wěn)定計量比的熒光響應(yīng)，猝滅基團具有更高效率的猝滅性能，但是標記核酸將大大提高合成成本，增加檢測成本。因此現(xiàn)在仍然需要開發(fā)一種操作簡便、檢測成本低的生物小分子檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種免標記熒光基團及猝滅基團的高效、簡單、靈敏、選擇性好、檢測成本低的一種以G-四鏈體為猝滅基團于核酸適配體檢測生物小分子的熒光檢測試劑盒、使用方法及應(yīng)用。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：

一種以G-四鏈體為猝滅基團于核酸適配體檢測生物小分子的熒光檢測試劑盒，包括以下溶液：

檢測液：包括100-2000nM的檢測用核酸，濃度為100-1000mmol/L、pH為4-10的緩沖溶液，質(zhì)量分數(shù)為0.1％-10.0％的表面活性劑，防腐劑；其中檢測用核酸包括兩部分：1.可以識別待測生物小分子并形成G-四鏈體或富G二級結(jié)構(gòu)的核酸適配體，2.由連接于核酸適配體兩端的互補堿基序列形成的莖狀結(jié)構(gòu)，該莖狀結(jié)構(gòu)可嵌入熒光染料產(chǎn)生熒光。

熒光顯色液：包括濃度為0.1×-10.00×免標記熒光染料(原始溶液濃度為10000×)；濃度為100-1000mM，pH為4-10的緩沖溶液。