[發明專利]威尼斯鐮刀菌內源U6啟動子及其基于CRISPR/Cas9的基因編輯方法

有效

• 申請號: 202210314506.4
• 申請日: 2022-03-29
• 公開（公告）號: CN114410635B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 馬延和;童勝;李德茂;王欽宏;陳吳西;孫媛霞
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/80;C12N15/55;C12N15/65;C12N1/15;C12R1/77
• 代理公司: 北京知文通達知識產權代理事務所(普通合伙) 16051
• 代理人: 歐陽石文

1.一種來源于威尼斯鐮刀菌的內源U6啟動子，其特征在于，在威尼斯鐮刀菌中可誘導sgRNA的表達，以使Cas9在正確位置對靶標序列進行切割，所述內源U6啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

2.含有如權利要求1所述的威尼斯鐮刀菌的內源U6啟動子的表達盒。

3.如權利要求2所述的表達盒，其特征在于，包括所述內源U6啟動子，和與其可操作連接的sgRNA中參與識別目標基因靶點的序列以及gRNA scaffold。

4.如權利要求3所述的表達盒，其特征在于，所述的gRNA scaffold的核苷酸序列如SEQID NO：3所示。

5.含有如權利要求1所述的來源于威尼斯鐮刀菌的內源U6啟動子或如權利要求2至4任一項所述的表達盒的重組載體。

6.一種威尼斯鐮刀菌的基因編輯的方法，其包括如下步驟：將含有如權利要求1所述的來源于威尼斯鐮刀菌的內源U6啟動子介導的編輯目標基因的sgRNA片段和Cas9表達載體共轉化威尼斯鐮刀菌原生質體中，進一步篩選編輯成功的轉化子。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述Cas9表達載體中的調控元件包括如SEQID NO：5所示的PgpdA啟動子；Cas9蛋白；SV40 NLS為病毒SV40的核定位信號；構巢曲霉trpc的啟動子Ptrpc和終止子Ttrpc；潮霉素抗性基因Hyg；絲狀真菌自主復制子AMA1；

所述內源U6啟動子介導的編輯目標基因的sgRNA片段包括所述內源U6啟動子、sgRNA中參與識別目標基因靶點的序列以及gRNA scaffold。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述威尼斯鐮刀菌原生質體采用如下方法制備：收集威尼斯鐮刀菌孢子，并用無菌0.7 M氯化鈉洗滌后，酶解2小時，所述酶解采用的酶裂解液為：20mg崩潰酶+40mg蝸牛酶溶于10ml 0.7 M氯化鈉，并過濾除菌。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述威尼斯鐮刀菌的保藏編號為CGMCCNO.20740。

10.如權利要求7至9任一項所述的方法，其特征在于，進一步包括通過PCR或測序驗證目的基因編輯成功的轉化子。