[發明專利]一種來源于威尼斯鐮刀菌的啟動子及可視化基因敲除篩選方法

有效

• 申請號: 202210314499.8
• 申請日: 2022-03-29
• 公開（公告）號: CN114410634B
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 馬延和;童勝;李德茂;王欽宏;陳吳西;孫媛霞
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/80;C12N15/65;C12N1/15;C12R1/77
• 代理公司: 北京知文通達知識產權代理事務所(普通合伙) 16051
• 代理人: 歐陽石文

本發明公開了來源威尼斯鐮刀菌的高效內源強啟動子，以及適用于威尼斯鐮刀菌的可視化基因敲除轉化子篩選方法。利用該方法，如果目的基因片段隨機插入到威尼斯鐮刀菌的基因組上，則菌落呈現熒光；如果目的片段實現目標基因的同源敲除，則菌落不發出熒光。因此，可以輕松排除占絕大多數比例的隨機插入轉化子（有熒光），通過PCR專一性對沒有熒光的轉化子進行驗證，結果表明能夠顯著提高敲除轉化子的篩選效率。本發明提供的篩選系統實現了從低同源重組率菌株中方便、快速、高效的篩選到敲除轉化子。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及來源于威尼斯鐮刀菌的啟動子及可視化基因敲除篩選系統方法。

背景技術

威尼斯鐮刀菌是從3000多株真菌中篩選到的可用于發酵生產菌絲蛋白的工業菌株。該菌株發酵產生的菌絲蛋白與單細胞蛋白相比更加味美，具有類似肉質的組織結構，并且能夠提供很好的營養平衡，包括脂肪含量低，氨基酸種類齊全，富含微量元素、維生素及利于人胃腸蠕動的可食性粗纖維。此外，威尼斯鐮刀菌菌絲蛋白還具有很好的安全性，已在全球的18個國家獲得食品原料上市許可。因此，具有部分或全部替代動物性和植物性蛋白質食品的潛力。

基因工程是獲得優良性狀菌株的最有效方法之一。當前在威尼斯鐮刀菌中已有相應遺傳轉化體系的報道，但是由于同源重組率較低（Royer, J.C.; Christianson, L.M.;Yoder, W.T.; Gambetta, G.A.; Klotz, A.V.; Morris, C.L.; Brody, H.; Otani, S.Deletion of the trichodiene synthase gene of Fusarium venenatum: two systemsfor repeated gene deletions. Fungal Genet. Biol.1999,28, 68-78.），導致在原代轉化板上篩選靶基因敲除轉化體時往往費事費力。

因此，開發一套簡單的可視化基因敲除轉化子篩選系統有望從低同源重組率菌株中方便、快速、高效的篩選到敲除轉化子。

發明內容

針對現有技術的需求，本發明的目的在于提供來源于威尼斯鐮刀菌的高效內源強啟動子和適用于威尼斯鐮刀菌可視化基因敲除轉化子的篩選方法。

本發明公開了一種來源于威尼斯鐮刀菌的高效內源強啟動子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。該啟動子具體來源于威尼斯鐮刀菌TB01，分類命名為鐮刀菌Fusariumvenenatum，于2020年10月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC）（保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號），其保藏編號為CGMCC NO.20740。

本發明進一步提供包含所述的啟動子的重組載體、表達盒。

本發明進一步提供一種適于威尼斯鐮刀菌的可視化基因敲除的核酸，其特征在于，其包括順序為啟動子元件-熒光蛋白基因-左臂序列-抗性標記基因-右臂序列的核酸片段，其中所述啟動子元件是在威尼斯鐮刀菌中可高效啟動表達的啟動子，且與后續的熒光蛋白基因可操作的連接，所述左臂和右臂序列是待敲除基因區域的左臂和右臂序列。優選地，所述啟動子元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述熒光蛋白基因是GFP基因；所述抗性標記基因是neo抗性標記基因。

進一步優選地，其是pK2載體為骨架的載體。

本發明也提供所述核酸的構建方法，其包括如下步驟：

（1）將熒光蛋白基因與所述啟動子元件可操作連接后，構建至骨架載體中，獲第一重組載體；

（2）分別擴增待敲除基因區域的左臂和右臂序列，并將其無縫連接至含有抗性基因的骨架載體的抗性基因元件的兩側，獲得第二重組載體；