[發明專利]豬瘟病毒2型Erns

在審

• 申請號: 202210309412.8
• 申請日: 2022-03-27
• 公開（公告）號: CN114874995A
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發明（設計）人: 方維煥;王媛;李肖梁;許翰坤
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/10;C07K14/18;C12N15/866;C07K19/00;C12N15/70;G01N33/569;G01N33/577;G01N33/58;C12R1/19
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺;周世駿

本發明屬于獸用生物制品領域，本發明公開了一株豬瘟病毒2型E^rns蛋白的雜交瘤細胞株9B1，其保藏編號為CCTCC NO：C 202247。該單抗可與CSFV2型E^rns蛋白發生特異反應，不與牛病毒性腹瀉病毒1型(BVDV1型)E^rns蛋白反應。本發明適用于CSFV2型毒株感染豬與RecC?M1或E2蛋白免疫豬血清抗體的鑒別檢測，也可用于區分CSFV2型毒株感染豬與BVDV1型病毒感染豬血清抗體。

技術領域

本發明涉及豬瘟病毒2型E^rns蛋白特異性單克隆抗體細胞株的制備；基于該單抗建立阻斷ELISA體系，用于區分豬瘟病毒2型野毒株感染豬的血清抗體和標記疫苗或E2蛋白亞單位疫苗免疫豬的血清抗體，屬于獸用生物制品領域。

背景技術

豬瘟(classical swine fever，CSF)是感染家豬及野豬的重要病毒病，具有高傳染性和高致病性的特點，是世界動物衛生組織(OIE)規定必需報告的疫病之一，該病由黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起，在我國屬一類動物傳染病。

CSFV包含三個基因型(1型、2型和3型)，基因1型(CSFV1型)較為經典，而上世紀八十年代以來分離的毒株大多屬于基因2型(CSFV2型)。CSFV弱毒C株(以下簡稱C株)是由CSFV1型強毒株在兔體連續傳代致弱后得到，豬在接種C株后不會出現體溫反應，僅出現輕微的病毒血癥。C株被公認為安全有效的CSF疫苗，但不具備為相關檢測試劑盒提供鑒別CSFV野毒感染血清抗體和疫苗C株免疫血清抗體的能力。國內生豬主產區的CSFV流行的毒株以CSFV2型為主，如QZ14株、HZ08株、HuN23株、HLJ1株等，CSFV2型等不同型毒株的流行可能影響基于基因1型的C株疫苗免疫保護效果。因此，具有鑒別能力、對基因2型等流行毒株的新型疫苗研制對更有效地控制CSF流行至關重要。

CSFV同屬其他重要病原包括牛病毒性腹瀉病毒1型及2型(Bovine ViralDiarrhea Virus，BVDV；其1型和2型分別簡稱BVDV1和BVDV2)，它們與CSFV在血清學上有一定的交叉反應性。我國不少省份有豬感染BVDV的報道，主要可能為BVDV1型毒株，BVDV2型鮮有報道。CSFV和BVDV囊膜蛋白E^rns均由227個氨基酸殘基組成，具有高保守性，其上有中和表位，能產生的中和抗體，可用于開發基因工程亞單位疫苗。CSFV和BVDV的E^rns之間同源性較高，但在特定區域有一定差異，可能是兩者互相鑒別的靶點；在新型標記疫苗研制中，具有鑒別疫苗免疫動物和野毒感染動物的潛力。由歐盟多個科研機構聯合研發的重組疫苗CP7_E2alf及其配套檢測體系是研究較為深入的豬瘟標記疫苗，已獲歐洲藥品管理局許可(商品名CSF Marker)。CP7_E2alf的骨架為BVDV1型CP7株，通過反向遺傳學方法將其E2基因替換為CSFV Alfort/187毒株的相應區域構建而成，具有較好的免疫原性。此重組疫苗的弊端在于，雖然目前已有與之相配套的以BVDV1型E^rns為靶點的血清學鑒別檢測體系，但由于其與CSFV血清存在一定的交叉反應性，限制了其適用性。同時，由于該疫苗株基因組中包含了CSFV強毒株Alfort/187的基因組分，使得重組疫苗與野毒株之間有可能通過同源或非同源重組方式突變為強毒株，有潛在的生物安全隱患。

酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linked Immunosorbent Assays,ELISA)主要用于抗體檢測，廣泛應用于臨床，快速便捷且靈敏度高，不需要特殊的儀器設備。目前CSFV抗體檢測的商品化試劑盒多采用間接ELISA或阻斷ELISA方法，其中阻斷ELISA主要基于純度較高的特異性單克隆抗體，與特定的包被抗原結合，可顯著提高檢測的特異性，減少間接ELISA方法可能出現的非特異性反應。