[發(fā)明專(zhuān)利]用于肺炎鏈球菌RPA-LFS檢測(cè)法的引物探針組合及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210306348.8
• 申請(qǐng)日: 2022-03-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114657272A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-06-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高緒柱;王方;王蕾;黃關(guān)宏
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 連云港市第二人民醫(yī)院(連云港市臨床腫瘤研究所）
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/689
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/46
• 代理公司: 無(wú)錫蘇元專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 32471
• 代理人: 張洪偉

本發(fā)明公采用RPA結(jié)合LFS技術(shù)，建立了一種快速、靈敏的肺炎鏈球菌現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法。該方法根據(jù)肺炎鏈球菌自溶素基因(lytA)設(shè)計(jì)引物探針，并且在37℃，30min內(nèi)完成檢測(cè)。通過(guò)對(duì)22株肺炎鏈球菌的臨床分離株及20株其它常見(jiàn)病原菌進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證了該方法的特異性。對(duì)RPA?LFS方法的靈敏度進(jìn)行了10次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，最低檢測(cè)限為3.32個(gè)集落形成單位(CFU)/反應(yīng)。最后，對(duì)所建立的肺炎鏈球菌RPA?LFS檢測(cè)方法進(jìn)行了臨床標(biāo)本的檢測(cè)，與PCR方法相比，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確一致。總之，本研究開(kāi)發(fā)了一種快速、靈敏和特異的肺炎鏈球菌RPA?LFS檢測(cè)方法，在偏遠(yuǎn)和資源有限地區(qū)的初步醫(yī)療診斷中有很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及肺炎鏈球菌的檢測(cè)，具體為用于肺炎鏈球菌RPA-LFS檢測(cè)法的引物探針組合及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

肺炎鏈球菌(S.Pneumoniae)是一種革蘭染色陽(yáng)性，無(wú)鞭毛，常為成對(duì)或短鏈狀排列的細(xì)菌，其外面由多糖組成的莢膜為致病的物質(zhì)基礎(chǔ)。這種細(xì)菌在自然界中分布廣泛，常定殖在人上呼吸道器官黏膜，主要侵害的對(duì)象是免疫力低下的人群，例如兒童和老年人，感染后會(huì)引起肺炎、腦膜炎、中耳炎等侵襲性疾病，在全球每年肺炎鏈球菌感染導(dǎo)致了極高的發(fā)病率與死亡率；隨著越來(lái)越多高耐藥性肺炎鏈球菌臨床分離株的出現(xiàn)，肺炎鏈球菌感染的防治變得越發(fā)困難。而及時(shí)準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷，對(duì)臨床治療藥物的選擇和治療方案的制定起到十分重要的作用。

在患者患病早期，通過(guò)及時(shí)準(zhǔn)確的診斷出病原體，及早反映出臨床感染，有利于對(duì)患者進(jìn)行后續(xù)的正確治療。然而，目前檢測(cè)肺炎鏈球菌的金標(biāo)準(zhǔn)方法是基于表型的，包括培養(yǎng)、顯微鏡檢查和生化鑒定。肺炎鏈球菌的生長(zhǎng)和鑒定通常需要兩天以上，并且該方法通常具有檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜以及容易出現(xiàn)假陰性的缺點(diǎn)。

目前陽(yáng)性鑒定可能通常發(fā)生在感染過(guò)程的后期；這種延誤的診斷可能會(huì)導(dǎo)致感染該病原菌患者的預(yù)后不佳。因此，開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證一種快速、準(zhǔn)確的肺炎鏈球菌鑒定方法勢(shì)在必行。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種用于檢測(cè)肺炎鏈球菌的非培養(yǎng)方法，包括質(zhì)譜法、免疫分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、實(shí)時(shí)PCR、聚合酶螺旋反應(yīng)(PSR)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)；與金標(biāo)培養(yǎng)法相比，這些肺炎鏈球菌鑒定試驗(yàn)可以節(jié)省相當(dāng)多的時(shí)間。然而，這樣的分析反過(guò)來(lái)依賴于技術(shù)人員或復(fù)雜的設(shè)備，而這在某些情況下可能是不可用的。

重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Recombinase Ploymerase Amplication,RPA)是由重組酶聚合酶介導(dǎo)的擴(kuò)增，模擬生物體內(nèi)DNA復(fù)制，在常溫下即可對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增。該技術(shù)主要依賴于三種酶：T4噬菌體編碼的重組酶蛋白u(yù)vsX和uvsY、單鏈結(jié)合蛋白gp32及Bsu DNA聚合酶。其中，重組酶蛋白可以與引物結(jié)合，形成DNA核蛋白微絲，微絲可以結(jié)合匹配的DNA片段，并緊密結(jié)合發(fā)生重組，在單鏈結(jié)合蛋白的幫助下,模板DNA開(kāi)始解鏈,在BsuDNA聚合酶的作用下進(jìn)行復(fù)制延伸,對(duì)模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。整個(gè)過(guò)程僅需在37-42℃下反應(yīng)20-30分鐘即可完成，與PCR相比，整個(gè)過(guò)程不需要高溫變性和低溫退火，反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速高效。將包被金納米顆粒(AuNPs)的側(cè)向流動(dòng)帶(LFS)與RPA結(jié)合起來(lái)對(duì)標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行目視檢測(cè)，用肉眼即可在LFS上半定量地觀察彩色信號(hào)。該技術(shù)進(jìn)一步簡(jiǎn)化了檢測(cè)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了無(wú)需儀器的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明采用RPA結(jié)合LFS技術(shù)，建立了一種快速、靈敏的肺炎鏈球菌現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法。