[發明專利]一種絲綢織物上黑曲霉菌氧濃度閾值試驗方法

在審

• 申請號: 202210302159.3
• 申請日: 2022-03-24
• 公開（公告）號: CN114672535A
• 公開（公告）日: 2022-06-28
• 發明（設計）人: 黃陽陽;李邦玉;崔鳴;馬思毓;何麗麗;查思雨
• 申請（專利權）人: 蘇州市職業大學
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;G01N33/00;C12R1/685
• 代理公司: 蘇州大智知識產權代理事務所(普通合伙) 32498
• 代理人: 王軍

1.一種絲綢織物上黑曲霉菌氧濃度閾值試驗方法，其特征在于，包括以下步驟：

一、器材滅菌

1、培養基和無菌水制備并包扎后進行高壓蒸汽滅菌溫度設置為121℃，維持15-30min；

2、超凈工作臺和無菌室進行紫外燈照射30min；實驗裝置用75%酒精擦拭后再紫外燈照射滅菌30min；

3、玻璃器皿清洗包扎后進行干熱滅菌，溫度設置為160℃，維持1-2h；

二、樣品處理

將標準絲貼襯面料剪成直徑為2.5cm±0.5cm的圓片，用報紙包扎后進行干熱滅菌，溫度設置為60℃，維持30min，以達到滅菌的目的；

三、培養基制備

待將融化的PDA培養基冷卻至45-50℃左右后，按無菌操作倒平板，每皿約傾倒20-25ml,左三圈右三圈輕輕搖動培養皿，使培養基均勻分布在培養皿底部，平置于桌面，待凝固后即為平板；

四、黑曲霉孢子液的制備

取無菌水10ml倒入培養好的平板黑曲霉菌種中，用無菌接種環輕刮菌種表面洗出孢子，將孢子液倒入離心管內；用速度4000r/min離心孢子液，去上清；用10ml無菌水洗滌沉淀后，再離心；用此法清洗３次；加入10ml±0.1ml無菌水稀釋洗滌后的孢子；

五、黑曲霉的接種培養

吸取1ml±0.1mml 的黑曲霉菌懸液，置于無菌平板中，用無菌涂布棒將菌懸液分散于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基表面；將絲綢圓片放入平板中央，使其全部浸濕；

六、試驗環境的控制

將平板放置在倒置的保鮮盒頂部，下邊放置十一個無菌的空平板抵著，使其放置更穩定；各裝置所需氧氣濃度分別為1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%、19%、20.8%，通過保鮮盒上的小孔進行充氮氣，通過傳感器上的液晶顯示器觀察充入的氧氣濃度，待氧濃度達到相應的濃度值時，暫停通入氮氣并關閉孔塞；因罐內空氣濃度需要平衡，因此需待氧濃度值穩定后，根據實際氧濃度的偏差情況，重新向罐內補充氮氣或氧氣，調節罐內空氣平衡和穩定在所需氧濃度；待各裝置的氧氣濃度穩定到所需濃度后，倒置放入PET食品盒內，并加入約700ml無菌蒸餾水，使得水位線超過密封保鮮盒蓋的接縫處，利用水封保證罐內氣體的密封效果；然后蓋上食品盒的蓋子，并用鋁箔膠帶對箱子的接縫處進行密封，避免外界環境對食品盒內的無菌去離子水產生污染；外盒的壁上打孔并安裝雙向USB接口，分別連接內盒外壁上的無線充電裝置發射器，以及外界USB電源，從而保證試驗期間傳感器裝置的連續供電；

七、培養與觀察

培養前，對培養環境紫外滅菌30min；在溫度為28℃±1℃，濕度為60%-80%的環境中，培養7d，培養期間每天定期觀察霉菌的生長狀態和氧濃度的變化，并記錄；

八、結果與分析

霉菌培養初始階段的20h-24h，所有樣品的氧濃度都沒有明顯的降低，此時霉菌孢子正處于發育狀態，耗氧量非常小；24h之后所有樣品的氧濃度都出現了迅速降低的趨勢，初始氧濃度越高的樣品，其黑曲霉菌生長的速度越快，顏色呈現的黑色越深，此時黑曲霉菌的孢子已經處于快速發育的狀態；初始氧濃度1%-7%的黑曲霉樣品，當霉菌生長環境中的氧含量濃度降至0.7%-0.8%時，氧濃度不再降低，培養皿中黑曲霉菌的生長也處于停滯狀態，顏色不再發生明顯變化，說明黑曲霉菌生長的氧濃度閾值區間為0.7%-0.8%，氧濃度降至該區間內時，黑曲霉菌會進入休眠的狀態；初始氧濃度7%-20.8%的黑曲霉樣品，氧含量濃度只可降低至一定程度，但培養皿中黑曲霉菌的生長也處于停滯狀態；霉菌能夠快速生長繁殖的必備條件主要有環境中氧濃度、環境溫度、環境濕度、營養物質等，所以猜測氧氣濃度未降到0.7%的原因可能是由于培養皿中營養物質不足，缺少黑曲霉生長所需的碳源、氮源及磷、鉀、鎂等元素，使得黑曲霉的生長也處于停滯狀態；綜上所述，黑曲霉菌生長的氧濃度閾值區間為0.7%-0.8%，降至此區間內時，黑曲霉會進入休眠狀態。