[發(fā)明專(zhuān)利]編碼AM79 EPSPS蛋白的核酸分子及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210299466.0
• 申請(qǐng)日: 2022-03-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114606249A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-06-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 樓億圓;何軍光;任鑫;苗昱婷;周駿;趙振寧;李焰;陸建明;張凌燕;李靜靜
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江新安化工集團(tuán)股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/54
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/54;C12N9/10;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 溫可睿

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及編碼AM79EPSPS蛋白的核酸分子及其應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)AM79EPSPS不同區(qū)域的活性分析及單子葉植物(玉米)基因組特點(diǎn)，對(duì)AM79EPSPS的密碼子進(jìn)行了改造，經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的AM79EPSPS基因命名為ZMAM79?1EPSPS。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)AM79EPSPS基因及ZMAM79?1EPSPS基因的作物不同轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的分析，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)ZMAM79?1EPSPS基因更容易獲得高表達(dá)量的轉(zhuǎn)基因作物以及顯著提高獲得耐受高倍(4倍以上)草甘膦的轉(zhuǎn)基因作物的幾率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及編碼AM79 EPSPS蛋白的核酸分子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

玉米(Zea mays L.)是世界上種植最廣泛的農(nóng)作物之一。大約30％的玉米被直接食用，70％作為飼料。玉米也是我國(guó)種植面積最廣的農(nóng)作物。抗除草劑作物的創(chuàng)制是近代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中最活躍、最具成效的領(lǐng)域，抗草甘膦作物則是抗除草劑作物中的核心，其中抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆居于首位。

草甘膦(Glyphosate)為內(nèi)吸傳導(dǎo)型、光譜滅生性除草劑，其作用機(jī)制是通過(guò)抑制植物內(nèi)5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSPS)合酶的活性，干擾植物體內(nèi)芳香族氨基酸的生物合成，導(dǎo)致植物死亡。草甘膦具有廉價(jià)、藥性溫和和對(duì)人畜毒性小等優(yōu)點(diǎn)，是全世界使用量最大的除草劑品種。但是，該除草劑是一種非選擇性的除草劑，對(duì)農(nóng)作物有著同樣的殺死作用，為了能在作物出苗后使用草甘膦，需培育具有草甘膦抗性或降解性質(zhì)的農(nóng)作物。

為了培育抗草甘膦作物，從上世紀(jì)80年代，人們開(kāi)始將來(lái)自細(xì)菌的外源的抗草甘膦基因?qū)胫参锛?xì)胞中，并使之在植物細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，以提高轉(zhuǎn)基因作物對(duì)草甘膦的耐受性，其中最成功的例子是美國(guó)Monsanto公司將從根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)分離到的CP4 EPSPS基因?qū)胫参锛?xì)胞中，開(kāi)發(fā)了一系列的抗草甘膦作物。AM79 EPSPS基因編碼的蛋白屬于5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)，氨基酸序列與報(bào)道的Agrobacterium spEPSPS酶的氨基酸序列同源性僅為22％，兩者差異性顯著。

植物中的內(nèi)源EPSPS基因編碼的EPSPS是植物體內(nèi)芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，而這些芳香族氨基酸都是構(gòu)建細(xì)胞蛋白最基本的氨基酸。在這一生物合成途徑中，EPSPS酶催化莽草酸-3-磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-烯醇式丙酮酸莽草酸-5-磷酸。除草劑草甘膦可以抑制植物內(nèi)源EPSPS的活性，從而阻斷芳香族氨基酸的合成，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。來(lái)自于土壤的AM79 EPSPS基因編碼產(chǎn)生的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(AM79 EPSPS)蛋白與植物內(nèi)源EPSPS蛋白相比，對(duì)草甘膦的親合力大大降低，在草甘膦存在的條件下保證了植物對(duì)芳香氨基酸的合成，從而使植物免于草甘膦的殺滅作用。

AM79 EPSPS基因是從受草甘膦污染的土壤微生物的宏基因DNA中分離而來(lái)，但由于微生物表達(dá)系統(tǒng)的密碼子偏好性與植物十分不同，從而導(dǎo)致微生物基因的在植物中的表達(dá)延遲和表達(dá)降低。此前研究表明，將AM79 EPSPS基因的野生型序列直接導(dǎo)入玉米后不能高效表達(dá)，達(dá)不到該轉(zhuǎn)基因玉米植株對(duì)草甘膦高耐受性的效果。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供適合玉米表達(dá)的編碼AM79EPSPS蛋白的核酸分子及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供的編碼AM79 EPSPS蛋白的核酸，包括I)～I(xiàn)II)中至少一種：

I)、具有如SEQ ID NO:2～4任一項(xiàng)所示核苷酸序列的核酸；

II)、在I)所述的片段中取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸的核酸；

III)、與I)或II)中任一項(xiàng)部分互補(bǔ)或完全互補(bǔ)的核酸。