[發明專利]一種檢測牛痘病毒加帽酶活性的方法

有效

• 申請號: 202210298041.8
• 申請日: 2022-03-25
• 公開（公告）號: CN114395613B
• 公開（公告）日: 2022-06-28
• 發明（設計）人: 鄭紫君;李亞麗;湯玉潔;周玥;趙曼曼;張清儀;王明明;朱化星
• 申請（專利權）人: 蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48;C12Q1/44;C12Q1/686
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 徐迅;馬莉華

1.一種體外定量檢測牛痘病毒加帽酶的活性的方法，其特征在于，包括步驟：

(S1) 提供5'末端為5'-三磷酸的單鏈RNA分子；

(S2) 在含有3' Biotin GTP的檢測反應體系中，使用牛痘病毒加帽酶對所述的單鏈RNA分子進行加帽反應，獲得含加帽產物的第一反應混合物，其中所述加帽產物為含生物素修飾GTP的RNA分子；

(S3) 從所述第一反應混合物中分離出所述加帽產物；

(S4) 對所述加帽產物進行RT-PCR，測定的CT值為C1，并將C1與參考CT值C0進行比較，獲得CT差值；將所述CT差值與標準值或標準曲線比較，從而獲得牛痘病毒加帽酶的活性的定量測定結果；其中，

所述C0為陰性參考體系的CT值，其中，所述陰性參考體系的條件同所述的檢測反應體系，但不含有牛痘病毒加帽酶；并且在陰性參考體系中對所述的單鏈RNA分子進行加帽反應，獲得陰性反應混合物，然后對陰性反應混合物進行RT-PCR，測定的CT值記為C0；或

所述C0為第一反應混合物參考品的CT值，其中，將第一反應混合物分出一份，記為第一反應混合物參考品；并在步驟(S3)中，從剩余的第一反應混合物分離出所述加帽產物；然后對所述第一反應混合物參考品進行RT-PCR，測定的CT值記為C0。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一反應混合物參考品的體積為第一反應混合物體積的1/50至1/2。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一反應混合物參考品的體積為第一反應混合物體積的1/20至1/5。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(S1)中，所述單鏈RNA分子的長度為100-2000nt。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(S3)中，所述分離通過鏈霉親和素磁珠吸附反應進行。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(S3)中，所述分離包括：

(1)通過鏈霉親和素磁珠吸附第一反應混合物中的生物素修飾GTP的RNA分子；和

(2)通過洗滌(1)中的磁珠獲得含生物素修飾GTP的RNA分子的洗脫液。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(S2)中，在加帽反應前的反應體系中，所述3' Biotin GTP的終濃度為0.1mM-1mM。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(S2)中，加帽反應的反應時間為t，所述反應時間t為10min-1h。

9.一種檢測牛痘病毒加帽酶的活性的檢測裝置，其特征在于，所述裝置包括：

(d1)檢測模塊，所述的檢測模塊包括一個或多個檢測單元，其中，在所述檢測單元中含有：

反應室，所述反應室為含有3' Biotin GTP的檢測反應體系，使用待測牛痘病毒加帽酶對5'末端為5'-三磷酸的單鏈RNA分子進行加帽反應，獲得含加帽產物的第一反應混合物；

分離室，使用鏈霉親和素磁珠從所述第一反應混合物中分離出所述的加帽產物；

(d2)數據采集模塊，所述數據采集模塊被配置為對檢測模塊中，通過RT-PCR對各個檢測單元中，反應室與分離室的CT值進行數據采集；

(d3)分析模塊，所述分析模塊被配置為對來自所述數據采集模塊的CT值進行分析，將獲得的CT差值與標準數值或標準曲線進行對比，獲得待測的牛痘病毒加帽酶活性的分析結果；

(d4)輸出模塊，所述輸出模塊輸出篩選分析模塊的分析結果。

10.一種體外定量檢測牛痘病毒加帽酶的活性的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有：

(E1) 5'末端為5'-三磷酸的單鏈RNA分子；

(E2) 3' Biotin GTP；

(E3) 鏈霉親和素磁珠，所述的鏈霉親和素磁珠被配置為用于分離(E1)中所述的單鏈RNA分子的經牛痘病毒加帽酶催化形成的加帽產物；和

(E4) RT-PCR檢測試劑，所述的RT-PCR檢測試劑被配置為檢測(E1)中所述的單鏈RNA分子及其經牛痘病毒加帽酶催化形成的加帽產物。