[發明專利]鑒別‘洋紅松子殼’滇山茶品種的分子特異性標記引物及鑒定方法

在審

• 申請號: 202210286979.8
• 申請日: 2022-03-23
• 公開（公告）號: CN114574619A
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發明（設計）人: 鄭偉;顏成敏;徐曉丹
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.‘洋紅松子殼’滇山茶品種的分子特異性標記引物，其特征在于，該特異性標記引物序列如下：

上游引物：5'-ACATCGAAGAGCATGGCACA-3'；

下游引物：5'-GCCCCAAACTAGCACTCTCT-3'。

2.一種利用權利要求1所述的分子特異性標記引物對‘洋紅松子殼’滇山茶品種進行鑒定的方法，其特征在于所述方法為：

(1)提取待測滇山茶品種葉片的基因組DNA；

(2)以步驟(1)提取的滇山茶品種葉片的基因組DNA作為擴增模板，利用權利要求1所述分子特異性標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，獲得PCR擴增產物；

(3)對步驟(2)中的擴增產物進行電泳檢測，電泳結束后用EB染色，于Tanon凝膠成像儀拍照記錄結果，將電泳結果與DL2000Marker進行對比，若條帶大小為800bp，則對擴增產物進行DNA雙向測序，獲得擴增產物DNA序列；

(4)如步驟(3)中所述擴增產物的DNA序列能與NCBI線上數據庫的單拷貝核基因序列成功比對，且在431bp位點的核苷酸堿基為特異性位點G，則待測滇山茶品種為‘洋紅松子殼’，反之則否。

3.如權利要求2所述的對‘洋紅松子殼’滇山茶品種進行鑒定的方法，其特征在于，步驟(1)中所述提取待測滇山茶品種葉片的基因組DNA的方法為：取待測滇山茶葉片，加液氮磨碎后，以改良CTAB法進行基因組DNA提取。

4.如權利要求2所述的對‘洋紅松子殼’滇山茶品種進行鑒定的方法，其特征在于，步驟(2)中所述CR擴增體系，每50μL組成為：25μL Taq混合物；1μL DNA模板；22μL ddH2O；1μL濃度為10p的上游引物；1μL濃度為10p的下游引物。

5.如權利要求2所述的對‘洋紅松子殼’滇山茶品種進行鑒定的方法，其特征在于，步驟(2)中所述PCR擴增條件為：在98℃下初始變性2min，再在98℃下變性10s，60℃退火10s，72℃下延伸20s，進行35個循環；最后在72℃下延伸5分鐘。

6.如權利要求2所述的對‘洋紅松子殼’滇山茶品種進行鑒定的方法，其特征在于，所述步驟(3)中的電泳檢測方法為：取步驟(2)中的擴增產物2μL，與6μL 1×溴酚藍緩沖液混勻，點樣于1.0％的瓊脂糖凝膠上，于0.5×TBE緩沖液中，恒壓300V電壓下電泳12分鐘。

7.如權利要求2所述的對‘洋紅松子殼’滇山茶品種進行鑒定的方法，其特征在于，步驟(3)中所述擴增產物進行DNA雙向測序時采用一代3730測序儀。

8.如權利要求2所述的對‘洋紅松子殼’滇山茶品種進行鑒定的方法，其特征在于，步驟(4)中所述單拷貝核基因長度為786bp，在NCBI線上數據庫的GenBank登錄號為MH257932。