[發明專利]一種基于核磁共振磷譜的磷酸修飾酶活性的檢測方法

在審

• 申請號: 202210281337.9
• 申請日: 2022-03-22
• 公開（公告）號: CN114858838A
• 公開（公告）日: 2022-08-05
• 發明（設計）人: 應見喜;郭笑汎;韓博聞
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: G01N24/08
• 分類號: G01N24/08
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理有限公司 33226
• 代理人: 程曉明

一種基于核磁共振磷譜³¹PNMR的磷酸修飾酶活性的檢測方法，包括以下的步驟：(1):配制已知不同濃度的底物或產物的標準溶液，分別進行³¹PNMR測定，得到標準溶液的峰面積百分比，并將濃度與峰面積百分比繪制標準曲線；(2):通過³¹PNMR測得待測液的峰面積百分比，代入線性方程式得到底物或產物的初始濃度，將待測液、緩沖溶液和磷酸修飾酶進行混合孵育得到反應液，通過³¹PNMR檢測，得到反應液的底物或產物的濃度；(3):通過反應液的底物或產物的濃度底物或產物的初始濃度對比得到濃度的變化量，利用單位時間內濃度變化量計算得到酶活性；優點在于快速、簡便，不依賴于外源性試劑、可無污染回收樣品、抗干擾能力強，可進行實時監測，尤其適用于生物學領域。

技術領域

本發明涉及一種磷酸修飾酶活性的檢測方法，尤其是涉及一種基于核磁共振磷譜³¹P NMR的磷酸修飾酶活性的檢測方法。

背景技術

酶以共價鍵與磷酸基團進行可逆結合，引起酶結構的變化而呈現不同的活性，這類酶被稱為磷酸修飾酶，常見的磷酸修飾酶包括磷酸酶和激酶等。磷酸酶和激酶在人體內分布廣泛，常常被細胞用作應對外來刺激的常用信號傳導機制，磷酸酶是一種能夠將對應底物去磷酸化的酶，即通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團除去，并生成磷酸根離子和自由的羥基；激酶的作用與磷酸酶的作用正相反，激酶是磷酸化酶，可以利用能量分子，如ATP，將磷酸基團加到對應底物分子上。其他在細胞信號傳導通路中重要的磷酸修飾酶包括產生環核苷酸(例如環AMP(cAMP)和環GMP(cGMP))的環化酶和水解環核苷酸形成相應非環單磷酸核苷酸(即AMP和GMP)的磷酸二酯酶，環核苷酸環 AMP(cAMP)和環GMP(cGMP)是重要的第二信使，由于這些磷酸修飾酶在調節細胞功能中的重要作用，是探索和開發新的藥物療法的重要靶點，因此對磷酸修飾酶活性的檢測尤為重要。

目前用于磷酸修飾酶活性檢測分析的常用方法有：熒光法、高效液相色譜法(HPLC) 和毛細管電泳法(capillary electrophoresis，CE)等。熒光法是通過物質的熒光譜線位置及其強度進行物質鑒定和含量測定的方法，熒光增加量與蛋白酶活性成正比，通過熒光增加量來計算酶活性；HPLC法是根據待分離物質的性質不同，選用適當的色譜柱進行分離(親水色譜、疏水色譜、離子交換色譜等)，再用相應的檢測器進行檢測的一種分析手段，從而可以進行酶活性檢測。毛細管電泳是利用待分離物質的電荷不同，在電場作用下以毛細管作為分離通道對其進行分離的一種分析方法，再配合合適的檢測器，就可以將先后到達檢測器的物質檢測出來，從而可以進行酶活性檢測。

然而目前的這些方法都存在一定的局限性，熒光法分析酶活性會受到很多外部因素(比如說溫度，溶劑，酸度，熒光熄滅劑)的影響，會影響熒光效率；HPLC法的缺點在于會有“柱外效應”，在從進樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間(進樣器、柱接頭、連接管和檢測池等)中，如果流動相的流型有變化，被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬，柱效率降低；毛細管電泳存在由于毛細管直徑小，使光路太短，用這些檢測方法時，靈敏度較低且分離重現性不高的缺點；同時這些方法普遍需要進行復雜的樣品前處理，樣品浪費嚴重，操作過程繁瑣、效率不高，常常需要依賴外源性試劑且易受干擾等問題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種快速、簡便，樣品前處理簡單、可無污染回收樣品，檢測時無需依賴外源性試劑、抗干擾能力強且可進行實時監測的基于核磁共振磷譜³¹P NMR的磷酸修飾酶活性的檢測方法。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：

一種基于核磁共振磷譜³¹P NMR的磷酸修飾酶活性的檢測方法，包括以下的步驟：