[發明專利]一種胰蛋白酶抑制劑修飾的β-酪蛋白納米載體的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 202210278940.1
• 申請日: 2022-03-18
• 公開（公告）號: CN114716568B
• 公開（公告）日: 2023-06-16
• 發明（設計）人: 金鵬;非祖琪;杜琪珍;王圓圓;王滿
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

本發明公開了一種胰蛋白酶抑制劑修飾的β?酪蛋白納米載體的構建方法及其應用，屬于生物工程技術領域。本發明利用基于蛋白結構模擬、蛋白連接肽鏈Linker文庫構建和蛋白重組表達分析，構建Tsp3044和β?Cas的最優重組融合蛋白表達序列；從蛋白異源表達技術上優化表達系統、調控元件、發酵技術和提純工藝，實現重組Tsp3044/β?Cas融合蛋白的高效制備平臺；驗證了重組Tsp3044/β?Cas融合蛋白的結構自組裝與對抗蛋白酶消化的能力。本發明構建了具有顯著抵抗蛋白酶消化與腸胃高效遞送功能的高分子重組蛋白納米遞送系統，為酪蛋白靶向輸送藥物分子奠定了技術基礎，具有較大的應用潛能。

技術領域

本發明涉及一種胰蛋白酶抑制劑修飾的β-酪蛋白納米載體的構建方法及其應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

近年來，納米技術的快速發展已在醫藥、食品、化工和環境等領域發揮了巨大的作用，而高效的遞送體系和對生物活性成份的有效保護是納米技術在醫藥和食品科學等領域最重要的應用。因此，人們對納米技術的研究重點大都聚焦在先進納米材料的開發及應用上，并已取得了顯著的成效。例如，根據分子特性和用途特點用于遞送系統的各種納米載體，包括脂質體，醇質體，水凝膠和乳劑等等。酪蛋白是哺乳動物包括牛，羊和人奶中的主要蛋白質，而牛奶中的蛋白質80％以酪蛋白(Casein)為主。牛奶酪蛋白由于其優良穩定的乳化特性，價格低廉、來源廣泛、具有良好的生物相容性和生物可降解性等，被作為水包油型乳劑廣泛應用于疏水性藥物分子和活性化合物的乳化、遞送使用。

β-酪蛋白(β-Cas)作為酪蛋白最主要的組成成分，其理化特性與酪蛋白基本相似，具有兩親性和自組裝性。當前，其蛋白結構信息和核酸編碼序列已被報道，β-酪蛋白有一條單鏈209個氨基酸殘基多肽構成。特別是近年來蛋白分離純化技術和重組表達技術的發展，β-Cas膠束被廣泛應用為口服遞送載體，負載塞來昔布、布洛芬、米托蒽醌、柚皮素、紫杉醇以及紫杉烷(紫杉醇和多西他賽)和喜樹堿(伊立替康)等疏水性藥物，顯著提高了藥物的溶解度和穩定性。然而，盡管β-Cas納米口服遞送藥物在體外具有優異的成藥性，但在臨床使用過程發現藥物有效成分的吸收主要在小腸部位，而酪蛋白很容易被胃腸道蛋白酶液消化降解，從而導致納米遞送系統遭受嚴重破壞。因此，針對β-酪蛋白口服遞送系統易被胃/胰蛋白酶降解這一關鍵問題，亟需開發一種新的制備簡單、生物兼容性好和綠色無污染的制備技術，為β-Cas作為杰出的口服遞送系統并規模化應用奠定技術基礎。

蛋白酶抑制劑是一類廣泛存在于自然界中的非特異性對蛋白酶有抑制活性的物質，包括胰蛋白酶抑制劑、胃蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制劑等，主要參與生物體內蛋白酶活性的調節，能夠高效抑制蛋白酶水解活性。當前，已有大量來源于微生物、植物、動物的蛋白酶抑制劑編碼基因被報道，例如，蕎麥胰蛋白酶抑制劑編碼基因被克隆并通過DNA重組實現在原核大腸桿菌表達系統的活性表達。而牛肺來源的胰蛋白酶抑制劑作為商品化蛋白酶抑制劑被廣泛應用于臨床并成為重要的生化藥物之一。最近Zhang等人(High-level?expression?and?characterization?of?two?serineprotease?inhibitors?from?Trichinella?spiralis，公開于2016年)對來源于旋毛蟲的三種絲氨酸蛋白酶重組大腸桿菌系統異源表達，通過系統優化實現了三種蛋白酶抑制劑的高效重組表達，特別是蛋白酶抑制劑Tsp03044和TspAd5均對胃蛋白酶和胰蛋白酶表現出了明顯的活性抑制。

那么是否能夠利用蛋白酶抑制劑的性能提高β-Cas在人消化系統的耐受性、從而使藥物能夠精準送達到吸收部位，是目前仍待解決的問題。

發明內容

針對目前存在的問題，發明人嘗試將蛋白酶抑制劑與β-Cas進行融合，但是，蕎麥胰蛋白酶抑制劑、牛胰蛋白酶抑制劑等僅對胰蛋白酶有抑制活性，而對胃蛋白酶活性極低或沒有活性，故沒有取得預期的效果，因此，發明人發掘了來源于旋毛蟲的對胃蛋白酶和胰蛋白酶均有較好抑制活性的Tsp3044蛋白酶抑制劑，以期能夠提升β-Cas在消化系統中的耐受性、從而達到吸收部位。