[發明專利]一種一體化手持型數字核酸檢測儀及核酸檢測方法

在審

• 申請號: 202210275861.5
• 申請日: 2022-03-21
• 公開（公告）號: CN114540187A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 王欣璐;張浩卿;劉小成;朱含亮;帕維爾·諾伊茨爾
• 申請（專利權）人: 西北工業大學
• 主分類號: C12M1/38
• 分類號: C12M1/38;C12M1/34;C12M1/02;C12M1/00;C12Q1/686
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 王愛濤

本發明公開了一種一體化手持型數字核酸檢測儀及核酸檢測方法。該核酸檢測儀包括集成為一體的芯片加樣封裝系統、熱循環系統和檢測分析系統；芯片加樣封裝系統包括微孔型dPCR芯片以及對微孔型dPCR芯片進行封裝的封裝蓋片；熱循環系統用于對微孔型dPCR芯片進行熱循環；檢測分析系統用于拍攝熱循環結束后的微孔型dPCR芯片的熒光圖像，并對熒光圖像進行處理和分析。通過將芯片加樣封裝系統、熱循環系統和檢測分析系統三個部分小型化后集成為一臺儀器，簡化儀器結構降低儀器成本；并提出了一種基于PDMS和Parylene C多層結構的微孔型dPCR芯片柔性封裝工藝，解決了微孔性數字PCR芯片由于礦物油液封引起的樣品蒸發和交叉污染的問題。

技術領域

本發明涉及核酸檢測技術領域，特別是涉及一種一體化手持型數字核酸檢測儀及核酸檢測方法。

背景技術

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)可以在體外對核酸進行特異性擴增，是核酸檢測的金標準。對于雙鏈核酸即脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid，DNA)，PCR過程主要包括兩個部分：熱啟動和熱循環。熱啟動是在高溫下(約95℃)激活預混液中聚合酶的活性；熱循環是促使DNA在聚合酶的作用下進行復制。一個熱循環通常包括三個生物學過程：高溫變性、低溫退火和中溫延伸。在變性(約95℃)過程中，雙鏈DNA內部鏈與鏈之間的氫鍵被破壞，一條DNA雙鏈被分解為兩條單鏈DNA。然后在退火(約55℃)過程中，PCR預混液中的引物與單鏈DNA上的靶基因片段結合。在延伸(約72℃)過程中，在聚合酶的作用下將剩余的單鏈DNA序列合成雙鏈DNA。理想情況下，在每個熱循環結束后，DNA的拷貝數將會加倍。

為了量化PCR產物，實時熒光定量PCR技術在PCR預混液中加入熒光染料，利用其與DNA結合產生熒光的工作原理，對PCR過程進行實時觀測和定量分析，以此實現對目標基因(靶基因)的檢測，目前實時熒光定量PCR技術已經成為PCR檢測領域的主流方法。

為了實現對痕量靶基因的定量檢測，在傳統PCR的技術上發展出了數字PCR技術(dPCR,digital PCR)。是將含有熒光染料的PCR預混液平均分配到成千上萬個反應腔中，也就是將預混液中的所有靶基因隨機分配到這些反應腔中，有的腔室內沒有靶基因，有的腔室內含有至少一個靶基因。然后對這些反應腔進行熱循環處理，讓分配在這些反應腔內部的PCR預混液同時進行聚合酶鏈式反應。在反應結束后，含有靶基因的反應腔與沒有靶基因的反應腔之間的熒光強度會有明顯的區別。dPCR技術所需的樣品分割方法是基于微流控技術完成的。根據預混液的加樣方式，主要分為液滴式dPCR(droplet-based dPCR，ddPCR)和芯片式dPCR(chip-based dPCR，cdPCR)。ddPCR技術，利用微液滴發生器，將PCR預混液均勻地分割并包裹在油滴內，形成油包水液滴的虛擬反應腔。cdPCR技術，通過在硅/聚合物基底上利用微納米加工技術，形成微流控通道和微反應腔，然后樣品通過芯片流路或者直接移液的方法加載到芯片上，通過微加熱器對微反應腔進行熱循環處理，利用圖像處理算法對各個反應腔的熒光強度進行提取與分析

微孔型數字PCR芯片主要是通過半導體加工技術和軟光刻技術在基底材料硅或者聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)上制備出大量獨立的微孔，作為PCR反應腔。通過對微孔陣列芯片表面的化學處理，讓PCR預混液均勻地分布在各微反應腔內部，然后在芯片表面覆蓋硅油，防止反應腔室間樣品的交叉污染和溫度變化過程中溶液的蒸發，最后對整個芯片進行封裝。將封裝好的芯片放入熱循環系統中進行PCR過程。循環結束后，對產生熒光的微反應腔個數進行統計。通過熒光成像系統統計發出熒光的反應腔數量，并利用泊松分布進行分析，就可以得到原始PCR預混液中的靶基因含量。

現有的芯片式數字PCR檢測儀器結構復雜，儀器成本高。同時，芯片的封裝結構復雜，這導致熱響應速度的降低，熱循環所需時間延長，一次檢測的時間可達2小時。

發明內容