[發明專利]基于不對稱擴增的文庫構建引物組及其應用

有效

• 申請號: 202210275046.9
• 申請日: 2022-03-21
• 公開（公告）號: CN114592035B
• 公開（公告）日: 2023-03-24
• 發明（設計）人: 黃曉強;沈建如;陳遙;凌寶;賀亮;程雅婷;于世輝;馬驥
• 申請（專利權）人: 深圳金域醫學檢驗實驗室;廣州市金域轉化醫學研究院有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C40B50/06;C12Q1/6883;C12N15/11;C12Q1/6837
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 李海恬

1.一種基于不對稱擴增的文庫構建引物組，其特征在于，包括：接頭序列、由若干種基因特異性引物組成的引物池、通用擴增引物，所述接頭序列依次由配對莖結構序列、單分子標簽序列、第一樣本標簽序列和芯片固定序列組成，所述基因特異性引物由特異性互補引物、測序引物和第二樣本標簽序列組成；

所述基因特異性引物A的濃度為0.04-0.00004μM，所述通用擴增引物B的濃度為0.05-1μM，且所述通用擴增引物的摩爾濃度與所述基因特異性引物的濃度比k38，同時kn-4，n為基因特異性引物A的種類數；

所述特異性互補引物按照以下方法設計：獲取目標擴增基因參考序列作為引物設計模板，將模板序列分割為DNA片段，設計每段DNA片段的上下游引物，使所得擴增產物片段比所述DNA片段長20-50bp；且所述特異性互補引物長度為22-26nt，GC含量為45-55%，Tm為60-70℃，且Tm-L–Tm-X≥0；其中，Tm-L為特異性互補引物的熔解溫度，Tm-X為通用擴增引物的熔解溫度。

2.根據權利要求1所述的基于不對稱擴增的文庫構建引物組，其特征在于，所述配對莖結構序列為12±4bp互補配對的堿基對，所述單分子標簽為12±4nt的隨機堿基，所述第一樣本標簽序列為8±2nt的index1，所述第二樣本標簽序列為8±2nt的index2。

3.根據權利要求1所述的基于不對稱擴增的文庫構建引物組，其特征在于，所述芯片固定序列為20nt的P5序列。

4.根據權利要求1所述的基于不對稱擴增的文庫構建引物組，其特征在于，所述通用擴增引物序列如SEQ ID NO.1所示，所述特異性互補引物選自SEQ ID NO.2-412所示序列。

5.一種基于不對稱擴增的文庫構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

引物設計：獲取目標擴增基因參考序列作為引物設計模板，將模板序列分割為DNA片段，設計每段DNA片段的上下游引物，使所得擴增產物片段比所述DNA片段長20-50bp；

構建引物池：合成上述設計得到的引物，并在其一端添加測序引物和第二標本標簽序列；

制備接頭序列：制備權利要求1-4任一項所述的接頭序列，備用；

文庫構建：取待測樣本，提取核酸并加上所述接頭序列，純化去除多余接頭，加入權利要求1-4任一項所述的基因特異性引物和通用擴增引物，進行PCR擴增富集靶標區域，純化產物，采用通用引物與攜帶測序引物和第二樣本標簽序列配對的引物擴增靶標文庫，即得所述基于不對稱擴增的文庫。

6.根據權利要求5所述的文庫構建方法，其特征在于，所述引物設計步驟中，將所述引物設計模板分割為245bp長的DNA片段，并使相鄰的DNA片段之間有100bp的重疊區域。

7.根據權利要求6所述的文庫構建方法，其特征在于，所述引物設計步驟中，根據引物之間的距離調整引物，使2條相鄰的特異性互補引物之間的距離不小于100bp，且不大于225bp。

8.權利要求5所述的方法構建得到的基于不對稱擴增的文庫。