[發(fā)明專利]一種博落回小檗堿橋酶基因優(yōu)化序列及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210268913.6
• 申請(qǐng)日: 2022-03-18
• 公開（公告）號(hào): CN114517203A
• 公開（公告）日: 2022-05-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾建國(guó);黃鵬;徐子璇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/53
• 分類號(hào): C12N15/53;C12N15/81;C12N1/19;C12P17/12;C12R1/865
• 代理公司: 長(zhǎng)沙楚為知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 43217
• 代理人: 陶祥琲

本發(fā)明公布了一種博落回小檗堿橋酶基因優(yōu)化序列及其應(yīng)用,根據(jù)釀酒酵母的密碼子偏好性對(duì)博落回小檗堿橋酶基因(McBBE)進(jìn)行優(yōu)化后得到McBBE1、McBBE2、McBBE3、McBBE4和McBBE5，然后將五條優(yōu)化后博落回小檗堿橋酶基因序列分別轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中進(jìn)行表達(dá)，得到分別為YH01、YH02、YH03、YH04、YH05的菌株，然后通過(guò)搖瓶發(fā)酵和前體飼喂后，測(cè)定金黃紫堇堿產(chǎn)量，得出產(chǎn)量最高的菌株為YH03，最后將菌株YH03對(duì)應(yīng)的McBBE3序列整合進(jìn)釀酒酵母基因組，得到高產(chǎn)的金黃紫堇堿的釀酒酵母工程菌，提高M(jìn)cBBE在釀酒酵母中的催化效率，實(shí)現(xiàn)金黃紫堇堿產(chǎn)量的提高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程與生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種密碼子優(yōu)化的博落回小檗堿橋酶基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是單細(xì)胞真核生物，擁有蛋白質(zhì)修飾加工功能及同源重組機(jī)制，與其他真核生物相比，酵母擁有更清晰簡(jiǎn)單的遺傳學(xué)背景，同時(shí)由于其易操作性與安全性，是基礎(chǔ)研究中的模式生物。在合成生物學(xué)中，酵母常作為表達(dá)天然產(chǎn)物的微生物體系。

在蛋白翻譯的過(guò)程中，tRNA是一種重要分子，能特異性地直接將三聯(lián)密碼子和相應(yīng)的氨基酸聯(lián)系起來(lái)。因此，tRNA與密碼子在核糖體內(nèi)的相互作用，對(duì)蛋白翻譯過(guò)程的速率和精確度等方面有重要影響。在64個(gè)密碼子中，合成蛋白質(zhì)的20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸通過(guò)61個(gè)密碼子編碼翻譯而成，除了甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)外，其它氨基酸都有2-6個(gè)同義密碼子，即編碼同種氨基酸的不同密碼子。幾乎在所有物種中都發(fā)現(xiàn)有密碼子偏好性存在：編碼基因(Coding sequence，CDS)對(duì)密碼子的選擇是非隨機(jī)的，同義密碼子的使用頻率不同，并且在不同基因組中的擇傾向性也不同。

密碼子優(yōu)化是影響蛋白質(zhì)翻譯和功能的重要因素。根據(jù)表達(dá)宿主的密碼子偏好優(yōu)化目的基因，往往能顯著提高表達(dá)量。1982年，Bennetzem等在釀酒酵母中分析高表達(dá)基因的密碼子使用偏好,并和釀酒酵母的其它基因比較，發(fā)現(xiàn)這些基因?qū)γ艽a子選擇有一定的相似性，找到了釀酒酵母所偏好的22個(gè)密碼子。為釀酒酵母中異源基因的密碼子優(yōu)化提供了理論基礎(chǔ)。1996年釀酒酵母基因組全序列測(cè)序工作完成，基因組信息為酵母密碼子偏好的研究提供了更多依據(jù)。

CRISPR/Cas體系最早是在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的，是細(xì)菌針對(duì)噬菌體等外源DNA的獲得性免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要依賴于crRNA與Cas蛋白形成的核糖核蛋白復(fù)合物識(shí)別靶序列上的PAM結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對(duì)入侵噬菌體或質(zhì)粒進(jìn)行特異性切割。CRISPR系統(tǒng)主要有三種類型,其中II型體系僅需要一個(gè)Cas9蛋白、crRNA與tracrRNA就能行使其功能。有研究表明將crRNA與tracrRNA整合成sgRNA并不影響CRISPR/Cas9體系的作用。Dicarlo等人在2013年首次在釀酒酵母中使用了CRISPR-Cas9系統(tǒng)，他們將人工設(shè)計(jì)的sgRNA質(zhì)粒與供體DNA轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，實(shí)現(xiàn)了精氨酸通透酶基因的編輯，同時(shí)表明CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)釀酒酵母無(wú)明顯毒性。從此CRISPR-Cas9系統(tǒng)在釀酒酵母的應(yīng)用逐漸廣泛。

McBBE基因是博落回小檗堿橋酶基因的簡(jiǎn)稱，小檗堿橋酶參與催化網(wǎng)狀番荔枝堿((S)-Reticuline)轉(zhuǎn)化成金黃紫堇堿((S)-Scoulerine)，是血根堿合成途徑中的關(guān)鍵酶。目前已經(jīng)利用釀酒酵母體系對(duì)McBBE進(jìn)行了功能驗(yàn)證，但是已獲得的McBBE在釀酒酵母中的催化效率極低。因此亟需提高M(jìn)cBBE在釀酒酵母中的催化效率，提高金黃紫堇堿的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種密碼子優(yōu)化的博落回小檗堿橋酶基因及其應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：