[發(fā)明專利]抑制非必需高豐度蛋白表達(dá)以提高TG酶發(fā)酵水平的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210265587.3
• 申請(qǐng)日: 2022-03-17
• 公開（公告）號(hào): CN115029290A
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 白林泉;吳邦昊;王丹;步建國
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué);泰興市東圣生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/76;C12N15/113;C12N9/10;C12R1/465
• 代理公司: 上海漢聲知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31236
• 代理人: 胡晶

1.一種TG酶高產(chǎn)菌株，其特征在于，所述菌株的非必需高豐度蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄被抑制。

2.如權(quán)利要求1所述的TG酶高產(chǎn)菌株，其特征在于，在茂源鏈霉菌IPIO中通過CRISPRi技術(shù)分別降低了基因SMDS_5177、SMDS_758、SMDS_5989、SMDS_6427的轉(zhuǎn)錄水平。

3.一種用于降低蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄水平的整合型質(zhì)粒載體，其特征在于，所述載體分別抑制了茂源鏈霉菌IPIO的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶激活金屬蛋白酶抑制蛋白編碼基因SMDS_5177、短桿菌肽合酶C亞基蛋白編碼基因SMDS_758、苦霉素合酶模塊3和4蛋白編碼基因SMDS_5989、促自溶誘導(dǎo)蛋白編碼基因SMDS_6427的轉(zhuǎn)錄水平，含有靶向以上4個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)域的gRNA，通過降低基因轉(zhuǎn)錄水平抑制蛋白表達(dá)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的整合型質(zhì)粒載體，其特征在于，所述基因SMDS_5177的序列如SEQ ID NO.1所示，其對(duì)應(yīng)的gRNA_{SMDS_5177}的序列如SEQ ID NO.2所示；所述SMDS_758的序列如SEQ ID NO.3所示，其對(duì)應(yīng)的gRNA_{SMDS_5989}的序列如SEQ ID NO.4所示；所述基因SMDS_5989的序列如SEQ ID NO.5所示，其對(duì)應(yīng)的gRNA_{SMDS_5989}的序列如SEQ ID NO.6所示；所述基因SMDS_6427的序列如SEQ ID NO.7所示，其對(duì)應(yīng)的gRNA_{SMDS_6427}的序列如SEQ ID NO.8所示。

5.一種根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的整合型質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

在CRISPy-web網(wǎng)站上設(shè)計(jì)特異性靶向SMDS_5177啟動(dòng)子區(qū)域的gRNA，通過PCR擴(kuò)增得到含sgRNA_{SMDS_5177}基因序列的PCR片段，通過Gibson連接的方法連入整合型質(zhì)粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1中的SpeI/EcoRI位點(diǎn)，獲得整合型質(zhì)粒載體pLQ2103；

或，在CRISPy-web網(wǎng)站上設(shè)計(jì)特異性靶向SMDS_758啟動(dòng)子區(qū)域的gRNA，通過PCR擴(kuò)增得到含sgRNA_{SMDS_758}基因序列的PCR片段，通過Gibson連接的方法連入整合型質(zhì)粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1中的SpeI/EcoRI位點(diǎn)，獲得整合型質(zhì)粒載體pLQ2104；

或，在CRISPy-web網(wǎng)站上設(shè)計(jì)特異性靶向SMDS_5989啟動(dòng)子區(qū)域的gRNA，通過PCR擴(kuò)增得到含sgRNA_{SMDS_5989}基因序列的PCR片段，通過Gibson連接的方法連入整合型質(zhì)粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1中的SpeI/EcoRI位點(diǎn)，獲得整合型質(zhì)粒載體pLQ2105；

或，在CRISPy-web網(wǎng)站上設(shè)計(jì)特異性靶向SMDS_6427啟動(dòng)子區(qū)域的gRNA，通過PCR擴(kuò)增得到含sgRNA_{SMDS_6427}基因序列的PCR片段，通過Gibson連接的方法連入整合型質(zhì)粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1中的SpeI/EcoRI位點(diǎn)，獲得整合型質(zhì)粒載體pLQ2106。

6.一種高產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的茂源鏈霉菌菌株，其特征在于，將如權(quán)利要求3或4所述的整合型質(zhì)粒載體，或如權(quán)利要求5所述的方法構(gòu)建得到的整合型質(zhì)粒載體，通過接合轉(zhuǎn)移分別導(dǎo)入受體菌茂源鏈霉菌IPIO中進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組，獲得所述菌株。

7.一種提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，其特征在于，分別通過CRISPRi技術(shù)降低茂源鏈霉菌中SMDS_5177、SMDS_758、SMDS_5989、SMDS_6427的轉(zhuǎn)錄水平。