[發(fā)明專利]一種豬流行性腹瀉病毒感染性克隆的構建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210264769.9
• 申請日: 2022-03-17
• 公開（公告）號: CN114807223A
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發(fā)明（設計）人: 張滿義;梁軍;馮澤泰;任新蓉;蒲小峰
• 申請（專利權）人: 新疆方牧生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/50;C12N7/01;A61K39/215;A61P31/14
• 代理公司: 北京高航知識產權代理有限公司 11530
• 代理人: 喬浩剛

1.一種豬流行性腹瀉病毒感染性克隆的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，選擇G2型PEDV毒株作為研究對象；

步驟2，分析G2型PEDV毒株的基因組序列特征，找出G2型PEDV毒株S基因編碼氨基酸序列中特有的氨基酸突變區(qū)域；

步驟3，利用基因的克隆和載體構建技術，將PEDV感染性克隆受體結合域(ReceptorBinding Domain，RBD)替換成AscI酶切位點；

步驟4，使用人工細菌染色體技術(BAC)，獲取pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)質；

步驟5，將提取得到質粒pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)用AscI酶切線性化；

步驟6，線性化產物使用乙醇沉淀回收，回收產物與RBD突變體連接得到RBD突變質粒pBAC-PEDV(mut)，完成豬流行性腹瀉病毒感染性克隆的構建。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種豬流行性腹瀉病毒感染性克隆的構建方法，其特征在于，所述步驟1中，將豬流行性腹瀉G2株在Vero-CCL81細胞上傳至P3代。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種豬流行性腹瀉病毒感染性克隆的構建方法，其特征在于，所述步驟1中，將感染有G2型PEDV毒株的仔豬的空腸腸道組織樣品剪碎后勻漿，3000r/min離心5分鐘，取上清用0.22μm的濾器過濾除菌，接種生長良好的T-25單層Vero細胞，孵育1h后，棄去病毒液，用PBS清洗三次細胞后，加入10μg/ml胰酶的MEM培養(yǎng)基，置于37℃、含5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7日，觀察是否出現(xiàn)細胞病變，如此盲傳至細胞出現(xiàn)病變，收集培養(yǎng)物，凍融三次并命名，置-80℃以下超低溫冰箱中保存。

4.根據(jù)權利要求1所述的一種豬流行性腹瀉病毒感染性克隆的構建方法，其特征在于，所述步驟3中，利用反向遺傳技術，實現(xiàn)了對PEDV的感染性克隆。

5.根據(jù)權利要求1所述的一種豬流行性腹瀉病毒感染性克隆的構建方法，其特征在于，所述步驟3中，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術將原始pBAC-PEDV質粒的RBD替換成一個AscI酶切位。

6.根據(jù)權利要求1所述的一種豬流行性腹瀉病毒感染性克隆的構建方法，其特征在于，所述步驟3中，將RBD上游GG與下游CC之間的序列替換成CGCG形成一個AscI酶切位點，替換后的序列如下：GCTTTTGACCTTGACGATGGCGCGCCAAGTATACTATCTATGGCT。

7.根據(jù)權利要求1所述的一種豬流行性腹瀉病毒感染性克隆的構建方法，其特征在于，所述步驟4中，以pTargetF質粒為模板，用AscI-N20-F/AscI-N20-R引物進行PCR擴增sgRNA，以pBAC-PEDV質粒為模板，分別用AscI-updonor-F/AscI-updonor-R和AscI-downdonor-F/AscI-downdonor-R引物擴增上游供體和下游供體，得到一個新的質粒pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)。

8.根據(jù)權利要求1所述的一種豬流行性腹瀉病毒感染性克隆的構建方法，其特征在于，所述步驟6中，將連接產物轉化TG1，涂布于LB+壯觀霉素平板，37℃培養(yǎng)過夜，再通過感受態(tài)制備和質粒電轉化操作。

9.根據(jù)權利要求8所述的一種豬流行性腹瀉病毒感染性克隆的構建方法，其特征在于，從上述培養(yǎng)過作的平板上挑取大小中等形態(tài)正常的大腸桿菌單克隆至LB+Spe液體培養(yǎng)基，37℃220r/min培養(yǎng)，等菌液培養(yǎng)至肉眼可見混濁時用AscI-N20-F/AscI-downdonor-R引物進行菌液PCR驗證。

10.一種采用權利要求1～9任意之一所述的構建方法制備得到的豬流行性腹瀉病毒感染性克隆。