[發(fā)明專利]一種電轉染永生化豬成纖維細胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210263835.0
• 申請日: 2022-03-17
• 公開（公告）號: CN114574522A
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發(fā)明（設計）人: 莊樂南;趙語婷;賀津;張元;蔣思博
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/65;C12N15/54;C12N5/10;C12N5/071
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 余瑩

1.一種電轉染永生化豬成纖維細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將pCAG-floxP-neo-pH11載體通過單酶切得到線性載體，而后通過引物退火延伸得到hTERT片段，克隆到所述線性載體上；

(2)將所述線性載體轉化至感受態(tài)，進行菌落培養(yǎng)、PCR鑒定；

(3)PCR鑒定正確的質粒進行測序鑒定，序列正確的hTERT重組質粒進行擴大培養(yǎng)，然后通過質粒純化試劑盒純化，從而構建永生化載體pCAG-H11-hTERT；

(4)將pCAG-H11-hTERT及px459-H11-V2電轉染至豬原代成纖維細胞；

(5)用含有嘌呤培養(yǎng)基對細胞進行篩選，得到永生化成功細胞。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述單酶切采用Not I進行。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述感受態(tài)為E.coil DH5α；所述菌落培養(yǎng)基為含有氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為36-40℃培養(yǎng)12-16h；所述PCR鑒定是將培養(yǎng)后的菌落的菌液堿裂解法提質粒進行。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述質粒純化試劑盒為Endotoxin-Free的質粒純化試劑盒。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述hTERT的正確序列如序列表所示。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述電轉染中，兩個質粒比例為1:1，共轉染質粒6μg，細胞特異性核轉染液和pmaxGFP陽性質粒比例41：9，共100ul，使用儀器為Lonza 4D-Nnclea opector，轉染參數為DO-113。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中，由于px459-H11-V2中攜帶嘌呤抗性，若成功插入可以整合到豬的基因組中，因此用含有嘌呤培養(yǎng)基對陽性細胞進行篩選，篩選濃度為3.5ug/mL；同時設置一盤未電轉細胞作對照，對照細胞和電轉細胞依據細胞密度進行換液或者傳代，直至對照細胞全部死亡，則存活的電轉細胞視為含有嘌呤抗性的細胞即永生化成功細胞。