[發明專利]一種血清1型馬立克病病毒pp38單克隆抗體的制備方法及應用

有效

• 申請號: 202210261763.6
• 申請日: 2022-03-16
• 公開（公告）號: CN114540312B
• 公開（公告）日: 2023-03-24
• 發明（設計）人: 滕蔓;羅俊;羅琴;張改平;鄭鹿平;劉金玲;盧清俠;柴書軍;趙東;程娜
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/08;G01N33/569;G01N33/577;C12N15/85;C12N7/01;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務所(普通合伙) 41122
• 代理人: 張愛軍

本發明屬于基因編輯技術在動物免疫學技術領域中的新應用，公開了一種基于CRISPR/Cas9基因編輯技術篩選和鑒定抗血清1型馬立克病病毒特異性pp38蛋白單克隆抗體的方法及應用。其中抗MDV?1特異性pp38蛋白的單克隆抗體31G7由小鼠雜交瘤細胞株pp38?31G7產生，該細胞株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No:23025，單克隆抗體31G7的重鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO.3，輕鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO.4。該單克隆抗體31G7可以鑒別區分MDV?2和MDV?3毒株，適用于臨床中疑似病例的MDV不同血清型流行毒株的鑒別診斷。本發明方法大大提高了篩選針對MDV特定病毒蛋白的單克隆抗體的效率和準確性，同時也為其它皰疹病毒蛋白單克隆抗體的研制提供一種全新思路和可靠的技術手段。

技術領域

本發明涉及一種基于CRISPR/Cas9基因編輯技術構建血清1型馬立克病病毒MDV-1特異性pp38基因編輯缺失毒株，進行MDV-1特異性pp38蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞株的篩選、鑒定、單克隆抗體制備及應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

雞馬立克病(Marek’s disease，MD)是由馬立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)早期感染雛雞引發的一種最重要的免疫抑制病及腫瘤病。主要特征是外周神經、內臟器官(性腺、肝、脾、肺、腎、腺胃、腸道等)、虹膜、肌肉及皮膚內發生淋巴樣細胞浸潤，并最終發展成為淋巴瘤。MDV可經空氣傳播，傳染能力強，最終會誘發宿主產生內臟腫瘤和大批死亡，對全球養禽業年均導致約10-20億美元的巨大經濟損失，加上MDV感染宿主后產生免疫抑制導致臨床疫苗免疫預防效果不佳而產生間接影響，經濟損失無法估量。

MDV共有三種不同的血清型：血清1型(MDV-1)、血清2型(MDV-2)和血清3型(MDV-3，即火雞皰疹病毒HVT)。其中，只有MDV-1毒株具有致病性和致瘤性。根據致病性的不同，MDV-1毒株又可分為溫和毒(Mild MDV，mMDV)、強毒(Virulent MDV，vMDV)、超強毒(Veryvirulent MDV，vvMDV)以及特超強毒(Very virulent plus MDV，vv+MDV)。

MDV病毒基因組為線性雙股DNA，全長約180kb。主要由一個長獨特序列區(Uniquelong，UL)和一個短獨特序列區(Unique short，US)構成，在兩個獨特序列區兩側分別是兩個序列完全相同的反轉重復序列區：長末端重復序列(Terminal repeat long，TRL)和長內部重復序列(Internal repeat long，IRL)以及短末端重復序列(Terminal repeat short，TRS)和短內部重復序列(Terminal repeat short，IRS)，獨特序列區中編碼的病毒基因與其它皰疹病毒具有高度保守性，而MDV特異性的病毒基因則主要位于反轉重復序列區TR/IR中。三種血清型MDV存在大部分相同的結構基因和功能基因外，致病性的MDV-1還被發現和鑒定編碼7個病毒特異性的基因，包括原癌基因meq、pp38基因、病毒端粒酶RNA(vTR)、病毒脂肪酶(vLIP)、病毒相關IL8基因(vIL8)和1.8kb mRNA以及潛伏感染相關轉錄因子(LATs)。

在MDV-1特異性基因中，38ku磷蛋白pp38是最早被發現的。pp38在MD腫瘤和細胞系中的表達存在差異，且是迄今為止在MDV誘發的腫瘤及非生產性腫瘤細胞系中唯一能檢出的MDV-1特異性抗原，參與淋巴瘤細胞MSB-1轉化狀態的維持。此外，pp38還參與淋巴細胞的早期細胞裂解性感染，對于產生足夠量的潛伏感染T細胞以及體內轉化狀態的維持來說是必需的。

pp38蛋白是MDV-1特有的病毒蛋白，制備識別該病毒蛋白的特異性單克隆抗抗，不僅可用于MDV-1特異性毒株的快速鑒定，還可以為進一步研究揭示pp38蛋白的功能，以及為MDV快速檢測診斷試劑的研發提供關鍵核心試劑。

發明內容