[發(fā)明專利]一種MDCK細胞系的馴化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210243326.1
• 申請日: 2022-03-11
• 公開（公告）號: CN114438019B
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發(fā)明（設計）人: 樂威;朱紹榮;吳熠瀟;王龍超
• 申請（專利權）人: 上海榮盛生物藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N1/36;C12N7/00
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發(fā)明提供了一種MDCK細胞系的馴化方法，包括先將MDCK細胞含血清的貼壁培養(yǎng)，之后進行無血清懸浮培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)液中添加適量的胰島素。本發(fā)明的馴化方法僅需15代左右的馴化代數(shù)即可獲得高生長速率且傳代穩(wěn)定的懸浮細胞，馴化成功率高，馴化時間短，馴化后獲得的細胞污染少、安全性高。

技術領域

本發(fā)明屬于病毒學領域，更具體地，本發(fā)明涉及一種MDCK細胞系的馴化方法。

背景技術

流感病毒一直對人類社會存在威脅，隨著近年來全球對流感疫苗的市場需求增加，流感疫苗的市場開發(fā)前景依舊巨大。流感疫苗目前主要仍采用雞胚生產(chǎn)，而動物細胞生產(chǎn)工藝正在逐步成為主流生產(chǎn)方式，該工藝不僅可以提升季節(jié)性流感疫苗的生產(chǎn)效率和有效性，更是有利于面對潛在的流感大流行爆發(fā)，可在短時間內(nèi)快速高效生產(chǎn)大流行流感疫苗。

目前上市的基于動物細胞培養(yǎng)技術的流感疫苗多為使用貼壁MDCK細胞，然而該培養(yǎng)模式仍存在諸多的弊端，如：血清的引入造成培養(yǎng)工藝的復雜性和批次間不穩(wěn)定性，且潛在的外源因子影響細胞生長和病毒復制；需要添加額外胰酶使細胞脫離微載體，增加了操作復雜性；微載體價格昂貴，使用后通常無法進行回收。而MDCK細胞在無血清培養(yǎng)基中的懸浮培養(yǎng)則可以避免以上問題，因生產(chǎn)工藝操作簡單，不添加血清，更易實現(xiàn)流感疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)。

將MDCK貼壁細胞馴化為懸浮細胞是實現(xiàn)MDCK細胞無血清懸浮培養(yǎng)的關鍵步驟。目前常用的方法為逐步降血清法和一步馴化法。諸多案例如 CN109929796A均表明了采用逐步降血清法細胞馴化時間長、步驟繁瑣、多出現(xiàn)細胞結團現(xiàn)象等缺陷，無法支持高密度生長。而直接馴化法如 CN107460156A公開了一種通過一步馴化法獲得的適應于無血清懸浮培養(yǎng)的 MDCK細胞，但該方法因對馴化使用的培養(yǎng)基有著較高的要求而存在較大偶然性，細胞馴化成功存在一定幾率，導致最終投入的總馴化時間也較長。

因此，本領域亟待開發(fā)進一步優(yōu)化的細胞馴化方法，以簡化培養(yǎng)程序、減少培養(yǎng)時間、控制培養(yǎng)成本，提高細胞馴化培養(yǎng)的成功率，促進流感疫苗的生產(chǎn)效率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種MDCK細胞系的馴化方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種MDCK細胞的馴化方法，所述方法包括：

(1)將MDCK細胞貼壁培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)的培養(yǎng)基含有血清；

(2)將(1)貼壁培養(yǎng)的細胞進行懸浮培養(yǎng)，每1～3日進行一次換培養(yǎng)液和傳代；懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)液中添加1～10mg/L胰島素，且該培養(yǎng)液中無血清。

在一種或多種實施方式中，步驟(2)中，添加胰島素后，傳代至第3～12 代，撤去胰島素；較佳地，在懸浮培養(yǎng)起始后，傳代至第4～11代后、較佳地至第5～8代后，撤去胰島素。

在一種或多種實施方式中，步驟(2)中，培養(yǎng)至傳代第10～26代后、較佳地至傳代第13～17代后，收獲細胞，該細胞為適于接種病毒和進行病毒擴繁的細胞。

在一種或多種實施方式中，步驟(2)中，添加1～8mg/L胰島素；較佳地添加1～6mg/L胰島素；更佳地添加1～5mg/L胰島素；更佳地添加1.5～4 mg/L胰島素。

在一種或多種實施方式中，添加2、3、4、5、6、7、8或9mg/L胰島素。

在一種或多種實施方式中，步驟(1)中，所述的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基， MEM培養(yǎng)基。

在一種或多種實施方式中，步驟(1)中，所述的培養(yǎng)基中添加5～15％血清，較佳地添加8～12％血清(如添加10％血清)。

在一種或多種實施方式中，步驟(1)中，MDCK貼壁細胞培養(yǎng)至細胞匯合度為75％～95％時、較佳地80％～90％時，棄去原培養(yǎng)基；較佳地，還包括用PBS洗細胞。