[發明專利]一種聯合檢測miRNA155和谷胱甘肽的熒光生物傳感器

在審

• 申請號: 202210241162.9
• 申請日: 2022-03-11
• 公開（公告）號: CN114609105A
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發明（設計）人: 黃加棟;李宗強;王玉;劉素;郭志強;朱志學;姚玉穎;朱鏡儒;李倩茹;李靜靜;張清心;徐婉晴
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C12Q1/68
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 牛芳

本發明屬于生物檢測技術領域，提供了一種聯合檢測miRNA和GSH的熒光生物傳感器，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO:1?4所示的連接探針L、掛鎖探針P、H1和報告探針H，Mg²⁺、phi29 DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、dNTP和GSH；所述掛鎖探針P的5’端磷酸化；所述DNAzyme鏈第39和40位堿基之間包含雙硫鍵；3’端修飾反向dT；所述報告探針H鏈5’端修飾熒光報告基團，第25位修飾熒光猝滅基團。該傳感器檢測限低，構建方法簡單，性能穩定，工藝成本低，適用于產業化生產和檢測的要求。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種檢測miRNA和谷胱甘肽的熒光生物傳感器。

背景技術

miRNA (small single-stranded, ss)是非蛋白質編碼小RNA，通過與蛋白質編碼基因的信息配對，在轉錄后水平上促進mRNA的切割或翻譯抑制，在基因調控中發揮重要作用。miRNA調控細胞內的許多生物學行為，包括細胞分化、增殖、凋亡、耐藥、血管生成、侵襲和轉移等。miRNA是一種重要的生物分子，是正常組織器官中不可缺少的結構和功能元素之一。

谷胱甘肽(GSH)是一種含γ-酰胺鍵和巰基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成。是一種哺乳動物體內含量較為豐富的含巰基的三肽類物質，具有抗氧化、清除自由基以及調控重要的細胞內的生理過程的能力。

目前，northern blotting是應用最廣泛的miRNA檢測方法。然而，基于雜交和印跡的northern blotting分析不適合大規模篩選目的。此外，該方法樣品消耗、勞動密集、敏感性差，探針標記容易引起樣品降解和環境污染。檢測谷胱甘肽的方法有比色法、雙光子發射法等，但它們都存在耗時、儀器昂貴、操作復雜等缺點。由于其無與倫比的靈敏度和特異性，實時定量PCR已成為各種核酸定量的高效檢測工具，也被認為是miRNA譜分析的金標準方法。然而，這種方法無法量化活性成熟miRNA，并且需要昂貴的儀器和訓練有素的專業操作人員。此外，設計用于miRNA檢測的PCR引物也比較困難。

發明內容

針對現有技術中的問題，本發明提供一種檢測miRNA和谷胱甘肽的熒光生物傳感器，檢測速度快、操作簡單。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案。

一種聯合檢測miRNA155和谷胱甘肽的熒光生物傳感器，包括：

核苷酸序列如SEQ ID NO:1-4所示的連接探針L、掛鎖探針P、DNAzyme鏈（H1）和報告探針H，Mg²⁺、phi29 DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、dNTP；

所述掛鎖探針P的5’端磷酸化；

所述DNAzyme鏈第39和40位堿基之間包含雙硫鍵；3’端修飾反向dT。

所述報告探針H鏈5’端修飾熒光報告基團，第25位修飾熒光猝滅基團。

優選地，所述連接探針L、掛鎖探針P和T4 DNA連接酶以環狀模板代替。

所述環狀模板的構建方法，包括：將掛鎖探針P與連接探針L在T4 DNA連接酶緩沖液中雜交，然后加入T4 DNA連接酶低溫下反應，然后滅活T4 DNA連接酶；純化后得環形模板。

優選地，所述生物傳感器還包括緩沖溶液；更為優選地，所述緩沖溶液中包含Mg²⁺。

一種包含上述熒光生物傳感器的檢測miRNA155的試劑盒。

優選地，所述試劑盒還包括miRNA155的標準樣品。

優選地，上述熒光生物傳感器或試劑盒在miRNA155存在下，也可用于檢測GSH的濃度。

一種采用上述生物傳感器或者試劑盒檢測miRNA155的方法，包括以下步驟：