[發(fā)明專利]于污染條件下分離腸道上皮細(xì)胞的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210240520.4
• 申請(qǐng)日: 2022-03-10
• 公開（公告）號(hào): CN114480255A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘麗;秦貴信;鮑男;趙元;劉佳偉;鄂天姣;趙進(jìn)鵬;孫會(huì);徐程宇;范夏蒲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12Q1/02;A01N1/02
• 代理公司: 北京金智普華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11401
• 代理人: 張曉博

1.一種于污染條件下分離腸道上皮細(xì)胞的方法，所述污染條件包括腸道以活菌計(jì)數(shù)計(jì)包含細(xì)菌數(shù)不低于10⁵cfu/m³、以及所述方法實(shí)施環(huán)境中采用GB/T16293-2010《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))浮游菌的測試方法》檢測浮游微生物不低于10⁴cfu/L，所述方法包括以下步驟：

得到去除組織周圍的結(jié)締組織和脂肪的腸道組織塊；

將所述腸道組織塊用0.05～0.25％胰酶消化處理，并用完全培養(yǎng)液終止消化，以得到組織消化液；

將所述組織消化液依次通過100μm細(xì)胞濾器和70μm細(xì)胞過濾器，離心，第一細(xì)胞沉淀；

將所述第一細(xì)胞沉淀用樣本稀釋液重懸至濃度為2×10⁸～1×10⁹個(gè)/mL，進(jìn)行密度梯度離心，即可得到第二細(xì)胞沉淀。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在對(duì)所述腸道組織塊進(jìn)行消化的處理?xiàng)l件為溫度-4～40℃，消化0-3h；在對(duì)所述組織消化液過濾后的離心條件為400～500g離心10～15min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣本稀釋液包含8.0g/L氯化鈉、0.2g/L氯化鉀、41.44g/L磷酸氫二鈉和0.24g/L磷酸二氫鉀，所述樣本稀釋液的pH 7.2～7.5；

所述完全培養(yǎng)基為包含10％胎牛血清、1％雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對(duì)第二細(xì)胞沉淀進(jìn)行鑒定的步驟。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，對(duì)第二細(xì)胞沉淀進(jìn)行鑒定的步驟具體包括：

將所述第二細(xì)胞沉淀用樣本稀釋液重懸后，400～500g離心10～15min，棄上清；

加入0.5～1.0mL 4℃預(yù)冷的固定劑，室溫或37℃孵育5～30min；

400～500g離心10～15min，棄上清；

加入預(yù)冷PBS洗滌；

加入1.0～3.0mL破膜劑室溫或37℃孵育5～15min，400～500g離心10～15min，棄上清；

加入0.1～1.0mL重懸液后，完成細(xì)胞計(jì)數(shù)；

加1～10μL濃縮型血清，37℃孵育5～30min，洗滌；

加入KRT8抗體室溫或37℃孵育30～120min，400～500g離心10～15min，棄上清，加1mLPBS重懸清洗2次；

加入熒光二抗，37℃避光孵育30～60min，400～500g離心10～15min，棄上清，加1mLPBS清洗2次，棄上清，加0.1mL PBS，混勻，最后上機(jī)檢測。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對(duì)所述腸道組織塊進(jìn)行凍存與復(fù)蘇的步驟。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，對(duì)所述腸道組織塊進(jìn)行凍存的步驟具體包括：

將所述腸道組織塊裝入凍存管中，加入凍存液，封口，置于4℃冰箱30min，隨后放入-20℃冰箱1.5h，最后放入-80冰箱保存；

對(duì)所述腸道組織塊進(jìn)行復(fù)蘇的步驟具體包括：將細(xì)胞凍存管從-80℃冰箱取出后迅速至于37℃水浴鍋中，并搖動(dòng)凍存管，使之迅速融化，取出組織塊，用PBS緩沖液清洗干凈，用于后續(xù)上皮細(xì)胞的分離、純化及鑒定。

其中，所述PBS緩沖溶液包含8.0g/L氯化鈉、0.2g/L氯化鉀、41.44g/L磷酸氫二鈉和0.24g/L磷酸二氫鉀，所述PBS緩沖液的pH為7.2～7.5。

其中，所述細(xì)胞凍存液為無血清細(xì)胞凍存液或含有10％二甲基亞砜、90％胎牛血清的混合溶液。