[發明專利]一種新型核酸測序系統

在審

• 申請號: 202210240499.8
• 申請日: 2022-03-10
• 公開（公告）號: CN114540473A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 陳路;林靜雯;唐超;宋俊偉;徐夢瑩;張丹;趙苑村
• 申請（專利權）人: 四川大學華西第二醫院
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;G16B30/10
• 代理公司: 重慶恩洲知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 50263
• 代理人: 蘭渝宏

本發明具體涉及一種新型核酸測序系統。本發明提供的系統在提高了條形碼和UMI的匹配率的同時，還可以提高DNA(例如，全長cDNA)的測序準確率，有助于在實際應用場景中獲得正確的信息。本發明系統有望在一定程度上解決單細胞或空間轉錄組全長測序中現階段存在的問題，具有廣泛的應用場景。

技術領域

本發明屬于基因測序領域，具體涉及一種新型核酸測序系統。

背景技術

隨著單細胞或空間轉錄組測序技術的發展，結合單細胞信息可以從細胞角度探究細胞異質性及細胞間差異，結合空間位置信息則可以深入理解組織微環境和細胞間的相互作用。目前成熟的單細胞或空間轉錄組測序手段都是將測序分子(cDNA)兩端接上區分單個細胞的條形碼(CB，Cell Barcode)或區分空間信息的條形碼(SB，Spatial Barcode)，以及每條cDNA都帶有唯一分子標識符(UMI，Unique Molecular Identifier)，接下來再通過下一代測序技術(NGS，Next Generation Sequencing)打斷cDNA后進行高通量測序獲得序列信息，最終再通過CB或SB區分出單個細胞或單個空間位置的序列信息。因此，獲得準確的SB(或CB)和UMI對于空間(或單細胞)轉錄組測序至關重要。

但NGS技術因其必須將cDNA打斷的特性，無法獲得序列全長信息，限制了區分同一個基因的mRNA因選擇性剪接(AS，Alternative Splicing)產生的多種異構體(isoforms)，不利于mRNA轉錄后水平調控和轉錄本多態性的研究。目前高通量測序平臺中，僅有作為第三代測序技術的牛津納米孔測序技術(ONT，Oxford Nanopore Technologies)和太平洋生物科學公司(PacBio，Pacific Biosciences)開發的單分子熒光測序(SMRT，SingleMolecule Real Time Sequencing)兩大測序平臺可以對全長cDNA實現端到端(end-to-end)的完整測序。PacBio的Iso-Seq工作流程作為全長cDNA測序的金標準，可以在一次運行周期內產生約二十萬條高質量的全長cDNA讀長(reads)。而ONT目前能以一張minion芯片產出百萬級別的reads數目，其強大的靈活性(flexibility)、可擴展性(scalability)和更低的成本，已經越來越受到各實驗室青睞，成為全長轉錄組研究的首選工具。

然而，ONT測序因納米孔讀取電信號的測序原理決定了其測序準確度相對較低，錯誤率可達5～25％，特別是同聚物(homopolymer)和串聯重復區域(tandem repeatsregion)的錯誤。如果需要對單細胞或空間轉錄組文庫(library)進行全長cDNA測序，會導致CB或SB無法被準確拆解，能正確識別的單細胞或空間位置的reads很少。

為解決這一問題，Volden等最早于2018年提出R2C2方法(Rolling CircleAmplification to Concatemeric Consensus)，即通過重組一段200bp的無關序列環化cDNA后利用滾環擴增(RCA，Rolling Circle Amplification)生成一條長的串聯重復序列(concatemer)并進行ONT測序，后將被多次測到的cDNA從其串聯重復序列拆解后進行相互矯正成共識序列(consensus)，以提高測序準確度。Volden等又在2020年將R2C2方法應用于商品化10×Genomic單細胞轉錄組平臺(10XR2C2)，但其拆解出SB的reads僅占所有reads的～32.75％，而同時拆解出SB和UMI的匹配率為～15.86％。除此之外，類似于R2C2但應用場景不同的方法也在近幾年不斷被開發出來，例如針對超短DNA的HiFRe、針對Phospho-RNA的CircAID-p-seq、針對循環腫瘤DNA(ctDNA，circulating tumor DNA)的TP53-specificCyclomicsSeq等方法，證明通過串聯重復序列矯正ONT的理論到了廣泛應用。