[發(fā)明專利]用于同時(shí)檢測PEV和PTV的直接擴(kuò)增熒光RT-PCR引物探針組和試劑盒及方法

在審

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• 申請日: 2022-03-10
• 公開（公告）號: CN114574632A
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于新友;王文秀;李天芝;唐娜;劉博;謝金文;谷英華
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 重慶航圖知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 50247
• 代理人: 王貴君

本發(fā)明公開了一種用于同時(shí)檢測PEV和PTV的直接擴(kuò)增熒光RT?PCR引物探針組和試劑盒及方法，所述引物探針組包括4條不同的引物和2條不同的探針，其中，2條擴(kuò)增PEV的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示；1條擴(kuò)增PEV的探針序列，其核酸序列如SEQ ID NO.5所示；2條擴(kuò)增PTV的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示；1條擴(kuò)增PTV的探針序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，可用于直接擴(kuò)增熒光RT?PCR同時(shí)檢測PEV和PTV，具有操作簡單、靈敏度高、特異性好、檢測速度快，成本低等顯著優(yōu)勢，適宜臨床大規(guī)模推廣應(yīng)用，具有良好的推廣價(jià)值和應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于同時(shí)檢測PEV和PTV的直接擴(kuò)增熒光RT-PCR引物探針組和試劑盒及方法。

背景技術(shù)

豬腸道病毒(porcine enteroviruse，PEV)是小RNA病毒科、腸道病毒屬，病毒粒子呈圓形，無囊膜，基因組為單股正鏈RNA。PEV僅能感染豬，各品種和日齡豬均可感染發(fā)病，多呈散發(fā)。PEV引起的腸道病毒病臨床癥狀可表現(xiàn)為腹瀉、呼吸道疾病、神經(jīng)癥狀及繁殖障礙等。能垂直傳播也能水平傳播，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

豬捷申病毒(porcine teschovirus，PTV)是小RNA病毒科、捷申病毒屬，病毒粒子呈球形，無囊膜，基因組為單股正鏈RNA。PTV唯一宿主是豬，引起的豬捷申病毒病長期以來一直被忽視，呈地方流行性。各品種和日齡豬均可感染發(fā)病，主要臨床表現(xiàn)為腦脊髓灰質(zhì)炎、繁殖障礙、肺炎、下痢、心包炎和心肌炎、皮膚損傷等等。PTV還具有持續(xù)感染的特性，豬群感染康復(fù)后可長期帶毒，排毒期長達(dá)3個(gè)月，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

熒光PCR技術(shù)以其無可比擬的優(yōu)勢廣泛應(yīng)用于豬病檢測中，傳統(tǒng)熒光PCR檢測需要病原核酸提取步驟，操作繁瑣，增加了實(shí)驗(yàn)室氣溶膠污染的概率，且可能因提取操作不慎導(dǎo)致檢測假陰性或假陽性結(jié)果，對實(shí)驗(yàn)室條件要求較高。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，一些生物試劑公司已經(jīng)開發(fā)出了直接擴(kuò)增熒光PCR擴(kuò)增試劑，試劑有耐高溫的酶制劑和促使病毒高溫裂解的試劑組分，已經(jīng)應(yīng)用新型冠狀病毒檢測中，但在獸醫(yī)領(lǐng)域相關(guān)報(bào)道較少。一種病原核酸檢測方法建立除試劑外，引物和探針是最關(guān)鍵的部分，尤其多重?zé)晒釶CR檢測病原的方法尚未成熟，對多種熒光PCR檢測引物和探針的設(shè)計(jì)并不容易，需要考慮不同引物和探針間的干擾和匹配性，各引物和探針的比例需要不斷優(yōu)化，并不是簡單隨意的配比，為達(dá)到最佳擴(kuò)增效果，還需要對擴(kuò)增反應(yīng)的退火溫度和反應(yīng)條件不斷優(yōu)化，確定最佳的引物探針配比和反應(yīng)條件。因此，在熒光PCR方法在建立過程中需要優(yōu)化各種條件。選擇不同廠家試劑進(jìn)行比對分析，選擇性價(jià)比高，檢測效果好的試劑，一種優(yōu)質(zhì)檢測方法的研制并非想的那么簡單，需要大量的時(shí)間和精力付出，不斷調(diào)試驗(yàn)證。

豬病毒性腹瀉是豬最重要的一類疾病，可造成仔豬大批量死亡，豬場損失嚴(yán)重，PEV和PTV均是導(dǎo)致豬腹瀉的重要病原，均能通過糞口途徑傳播。此外，PEV和PTV還均能引起豬神經(jīng)癥狀、繁殖障礙等，臨床上癥狀表現(xiàn)類似，很難區(qū)分，需要通過實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行鑒別。當(dāng)前存在分別針對PEV或PTV單項(xiàng)熒光PCR方法，但沒有同時(shí)檢測PEV和PTV熒雙重光PCR方法，且操作繁瑣，對實(shí)驗(yàn)室條件要求高，存在氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)。對PEV和PTV同時(shí)快速檢測是豬場亟需的技術(shù)，需要研制適合現(xiàn)場快速檢測、高效、靈敏、簡便的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于同時(shí)檢測PEV和PTV的直接擴(kuò)增熒光RT-PCR引物探針組；本發(fā)明的目的之二在于提供一種含有所述的引物探針組的試劑盒，該試劑盒操作簡單、靈敏度高、特異性好、檢測速度快，成本低，能同時(shí)檢測PEV和PTV，可以有效滿足豬場臨床PEV和PTV疑似病例的快速確診、疫情的流行病學(xué)調(diào)查；本發(fā)明的目的之三在于提供一種使用所述的試劑盒同時(shí)檢測PEV和PTV的方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

1、一種用于同時(shí)檢測PEV和PTV的直接擴(kuò)增熒光RT-PCR引物探針組