[發明專利]表達豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白單鏈抗體的重組腺病毒及其構建和用途

有效

• 申請號: 202210233469.4
• 申請日: 2022-03-10
• 公開（公告）號: CN114773457B
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 朱建國;王鳳青
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N15/13;C12N15/861;A61K39/42;A61P31/14
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

本發明涉及表達豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白單鏈抗體的重組腺病毒及其構建和用途。本發明的重組腺病毒基因組中至少具有由如SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列的豬抗體重鏈可變區VH和如SEQ?ID?No.2所示氨基酸序列的豬抗體輕鏈可變區VL以及由中間連接肽Linker構成的豬源單鏈抗體片段VH?Linker?VL。重組腺病毒表達的單鏈抗體ZW4?36能夠與豬流行性腹瀉病毒N蛋白特異性結合，抑制豬流行性腹瀉病毒對仔豬空腸組織的感染，顯著降低仔豬糞便中的病毒粒子含量(P0.05)，對豬流行性腹瀉病毒感染仔豬具有有效的保護作用。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，尤其是涉及表達豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白單鏈抗體的重組腺病毒及其構建和用途。

背景技術

豬流行性腹瀉病毒(porcine?epidemic?diarrhea?virus，PEDV)感染豬引起豬流行性腹瀉(porcine?epidemic?diarrhea，PED)，導致豬腹瀉、脫水、食欲不振、甚至導致豬死亡。各年齡段的豬都會被感染，年齡越小的豬，臨床表現越嚴重。疫苗接種是預防該病的方法之一，但是由于病毒毒株變異速度快，目前研制的疫苗的預防效果并不理想。

發明內容

針對現有技術存在的上述不足，本發明提供一種表達豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白單鏈抗體的重組腺病毒及其構建和用途。

本發明提供的重組腺病毒表達的單鏈抗體ZW4-36能夠與豬流行性腹瀉病毒N蛋白特異性結合，減弱豬流行性腹瀉病毒對仔豬空腸組織的感染，顯著降低仔豬糞便中的病毒粒子含量(P0.05)，對豬流行性腹瀉病毒感染仔豬具有有效的保護作用。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

本發明首先提供一種豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白單鏈抗體，其具有如SEQID?No.1所示的豬源抗體的重鏈可變區VH的氨基酸序列、如SEQ?ID?No.2所示的豬源抗體的輕鏈可變區VL的氨基酸序列和中間連接肽Linker的氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS，組成順序為VH-Linker-VL的豬源單鏈抗體片段。

在本發明的一個實施方式中，豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白單鏈抗體，記為單鏈抗體ZW4-36，具有如SEQ?ID?No.3所示的氨基酸序列。

本發明還提供一種豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白單鏈抗體的編碼基因，具有如SEQ?ID?No.4所示的核苷酸序列。

本發明還提供一種含有豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白單鏈抗體的重組質粒。

本發明還提供一種表達豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白單鏈抗體的重組腺病毒，其至少具有如SEQ?ID?No.1所示的豬源抗體的重鏈可變區VH的氨基酸序列、如SEQ?IDNo.2所示的豬源抗體的輕鏈可變區VL的氨基酸序列和中間連接肽Linker的氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS，組成順序為VH-Linker-VL的豬源單鏈抗體片段。

本發明還提供一種表達豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白單鏈抗體的重組腺病毒的制備方法，包括以下步驟：

(1)在單鏈抗體ZW4-36的5’端添加SalI酶切位點，3’端添加HindIII酶切位點，SalI酶切位點序列為GTCGAC，HindIII酶切位點序列為AAGCTT，單鏈抗體ZW4-36具有如SEQID?No.3所示的氨基酸序列；

(2)將單鏈抗體ZW4-36構建入穿梭質粒pAdTrack-CMV中，獲得重組穿梭質粒pAdTrack-ZW4-36；

(3)用PmeI酶將重組穿梭質粒pAdTrack-ZW4-36進行單酶切，回收線性化的質粒片段，轉化含pAdEasy-1的BJ5183感受態細胞，進行同源重組；