[發明專利]豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白的真核表達單鏈抗體及其制備和應用

有效

• 申請號: 202210233421.3
• 申請日: 2022-03-10
• 公開（公告）號: CN114790238B
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 朱建國;王鳳青;程曼玲
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N15/13;C12N15/85;A61K39/42;A61P31/14
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

本發明涉及豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白的真核表達單鏈抗體及其制備和應用。本發明的真核表達單鏈抗體至少具有由如SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列的豬抗體重鏈可變區VH和如SEQ?ID?No.2所示氨基酸序列的豬抗體輕鏈可變區VL以及由中間連接肽Linker構成的豬源單鏈抗體片段VH?Linker?VL。將該片段的編碼基因插入真核表達質粒pCMV?HA，構建成為重組真核表達質粒pCMV?HA?ZW1?7。將pCMV?HA?ZW1?7轉染IPEC?J2細胞，該單鏈抗體在IPEC?J2細胞中成功表達，分子量大小約為28kDa；該單鏈抗體在感染豬流行性腹瀉病毒48h和72h后，均能夠顯著降低豬流行性腹瀉病毒的滴度(P0.05)；具有一定的抵抗豬流行性腹瀉病毒感染的作用。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，尤其是涉及豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白的真核表達單鏈抗體及其制備和應用。

背景技術

豬流行性腹瀉(porcine?epidemic?diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine?epidemic?diarrhea?virus，PEDV)感染豬引起的豬的臨床表現為腹瀉、嘔吐、食欲不振甚至導致豬死亡的一種傳染性腸道疾病。不同年齡的豬感染PEDV以后，臨床表現嚴重程度不同，感染后的7日齡以內的新生仔豬的死亡率高達100％。PED在全球多個國家均有爆發，給全世界養豬產業造成嚴重的經濟損失。疫苗接種通常被認為是一種預防病毒性疾病的有效方法，但是由于PEDV的變異速度快，商業化疫苗在臨床中的預防效果并不理想。直接給機體輸入特異靶向致病原或致病原組成蛋白的抗體的被動免疫是一種有效方法。N蛋白是PEDV的結構蛋白之一，它除了參與病毒粒子的構成，還能夠調控病毒的復制和翻譯等，受到越來越多的關注。

單鏈抗體是基因工程抗體中的一種，通過一段柔性短肽Linker將抗體的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL連接而成，分子量小，免疫原性低，組織滲透性好，在疾病的檢測和治療中，顯示了巨大的應用潛力，已有越來越多的單鏈抗體被應用到臨床中。

發明內容

本發明提供一種豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白的真核表達單鏈抗體及其制備和應用。

本發明提供的真核表達單鏈抗體能夠與豬流行性腹瀉病毒N蛋白特異性結合，可降低豬流行性腹瀉病毒在豬小腸上皮細胞(intestinal?porcine?epithelial?cell?lineJ2，IPEC-J2)內的滴度，能夠用于抑制豬流行性腹瀉感染的研究。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

本發明首先提供一種豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白的真核表達單鏈抗體，其具有如SEQ?ID?No.1所示的豬源抗體的重鏈可變區VH的氨基酸序列、如SEQ?ID?No.2所示的豬源抗體的輕鏈可變區VL的氨基酸序列和中間連接肽Linker的氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS，組成順序為VH-Linker-VL的豬源單鏈抗體片段。

在本發明的一個實施方式中，豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白的真核表達單鏈抗體，記為ZW1-7，具有如SEQ?ID?No.3所示的氨基酸序列。

本發明還提供一種豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白的真核表達單鏈抗體的編碼基因，具有如SEQ?ID?No.4所示的核苷酸序列。

在本發明的一個實施方式中，編碼基因的核苷酸序列中進一步包含限制性內切酶位點XhoI和NotI，其中酶切位點XhoI的核苷酸序列如SEQ?ID?No.5所示，酶切位點NotI的核苷酸序列如SEQ?ID?No.6所示。

本發明還提供一種含有豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白的真核表達單鏈抗體的載體。

在本發明的一個實施方式中，所述載體為真核表達質粒。

在本發明的一個實施方式中，所述載體為pCMV-HA-ZW1-7真核表達質粒。