[發明專利]大腦皮層微血管和大血管RNA的純化分離液及其分離方法

在審

• 申請號: 202210233113.0
• 申請日: 2022-03-09
• 公開（公告）號: CN114369595A
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發明（設計）人: 李泰霖;王志;彭俊;彭英;唐亞梅
• 申請（專利權）人: 中山大學;中山大學孫逸仙紀念醫院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 陳嘉雯

本申請屬于生物技術領域，尤其涉及大腦皮層微血管和大血管RNA的純化分離液及其分離方法。本申請提供了大腦皮層微血管和大血管RNA的純化分離液，包括：第一緩沖液、第二緩沖液和第三緩沖液；其中，所述第一緩沖液包括4?羥乙基哌嗪乙磺酸HEPES、RNA酶抑制劑和Hank's平衡鹽溶液HBSS；所述第二緩沖液包括葡聚糖和第一緩沖液，所述葡聚糖的分子量為65000～75000；第三緩沖液包括動物血清和第一緩沖液。本申請提供了大腦皮層微血管和大血管RNA的純化分離液及其分離方法，可有效解決現有技術純化的大腦皮層血管純度不高，提取的RNA純度低，完整度低的技術問題。

技術領域

本申請屬于生物技術領域，尤其涉及大腦皮層微血管和大血管RNA的純化分離液及其分離方法。

背景技術

隨著分子生物學的迅速發展，核酸的研究越來越多。而大腦皮層血管RNA被廣泛應用于醫學研究、尤其是臨床診斷中。從大腦皮層血管樣本中提取高質量的總RNA，是進行下游的測序、qPCR、芯片檢測等技術的基礎。但是，在大腦皮層血管中提取高質量的總RNA存在技術難點，RNA難以保存是基因表達組研究的一大瓶頸。RNA非常脆弱，極難保存，由于自然界廣泛存在的RNA酶，包括組織內及病原體的RNA酶，使得RNA在室溫幾分鐘內就開始降解，30分鐘內完全降解成為檢測不可用的小片段，限制了RNA的試驗研究。

當前動物大腦皮層血管RNA純化的方法主要是將大腦組織勻漿后通過不同孔徑的篩網過濾分離微血管或者大血管組織，然后再提取組織RNA。但是現有技術方案純化的血管組織普遍純度不高，且常規方法中缺少對RNA保護的措施，獲得的RNA結構不完整，質量差，無法進行后續的RNA測序。

發明內容

有鑒于此，本申請提供了大腦皮層微血管和大血管RNA的純化分離液及其分離方法，可有效解決現有技術純化的大腦皮層血管純度不高，在其提取的RNA純度低，完整度低的技術問題。

本申請第一方面提供了大腦皮層微血管和大血管RNA的純化分離液，其特征在于，包括：

第一緩沖液、第二緩沖液和第三緩沖液；

其中，所述第一緩沖液包括4-羥乙基哌嗪乙磺酸HEPES、RNA酶抑制劑和Hank's平衡鹽溶液HBSS；

所述第二緩沖液包括葡聚糖和第一緩沖液，所述葡聚糖的分子量為65000～75000；

第三緩沖液包括動物血清和第一緩沖液。

具體的，第二緩沖液中的葡聚糖用于控制溶液密度，當使用大于75000分子量的葡聚糖時，由于溶液密度大，通過離心沉淀的血管組織較少，分離效率低，且離心時間長；當使用小于65000分子量的葡聚糖時候，血管組織和其他組織成分如髓鞘不能分離。因此，使用分子量為65000～75000的葡聚糖，使分離出來的大腦皮層微血管和大血管組織結構完整，純化的RNA分子結構完整，可以進行RNA測序。

具體的，所述葡聚糖的分子量為70000。

具體的，血管按照直徑大小可分為毛細血管(小于10μm)、微血管(10-50μm)、大血管(大于50μm)。大腦皮層富含各種類型血管，分離純化微血管和大血管目前是將大腦組織勻漿后可依次通過預置孔徑的濾膜，得到大腦皮層微血管和大血管，如可依次通過100μm和20μm孔徑的濾膜，沖洗獲得的濾渣即為對應直徑的血管(分別為大腦皮層微血管和大血管)。

另一實施例中，所述第一緩沖液中，所述Hank's平衡鹽溶液HBSS為溶劑，所述HEPES和所述RNA酶抑制劑為溶質，所述4-羥乙基哌嗪乙磺酸HEPES的終濃度為1％～5％；所述RNA酶抑制劑的終濃度為0.1％～0.5％。

另一實施例中，所述第一緩沖液中，所述RNA酶抑制劑選自焦碳酸二乙酯DEPC、異硫氰酸胍和氧釩核糖核苷復合物中的一種或多種。