[發明專利]一種常壓室溫等離子微生物誘變方法

在審

• 申請號: 202210232537.5
• 申請日: 2022-03-09
• 公開（公告）號: CN114457065A
• 公開（公告）日: 2022-05-10
• 發明（設計）人: 王維維;單玲玲;馮凡;陳勇
• 申請（專利權）人: 宿州學院
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C12N1/20;C12R1/15
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 謝歡

本發明屬于微生物誘變技術領域，具體涉及一種常壓室溫等離子微生物誘變方法，利用常壓室溫等離子系統對活化的菌懸液進行誘變，誘變結束后利用細胞膜修復液洗脫，靜置修復，接著用生理鹽水重懸；所述細胞膜是由無菌水、磷脂、乙酰膽堿按照100:0.5?1:0.1?0.3的質量比例混合而成的。本發明的方法提高了誘變過程中的微生物存活率，并且提高了正突變率，進而提高了誘變效率。

技術領域

本發明屬于微生物誘變技術領域，具體涉及一種常壓室溫等離子微生物誘變方法。

背景技術

微生物的變異是指外接因素使細胞內的DNA分子被破壞，產生堿基配對錯誤，從而導致的基因突變，包括正突變和負突變，基因突變對于篩選功能均具有重要的作用。常見的微生物誘變方法包括紫外誘變、化學誘變和等離子體誘變；其中，紫外誘變見光可修復，所以誘變后遺傳不穩定，并且突變率低；化學誘變由于采用了致癌的化學試劑，所以污染度高；等離子體誘變是在其滅菌原理的基礎上演變的，在等離子體誘變過程中，射線和粒子對細胞表層造成了直接刻蝕作用，改變了細胞膜的通透性，使得誘變因子能夠快速進入細胞并與DNA發生作用，該方法彌補了化學方法的高污染性，也解決了射線輻射誘變的遺傳不穩定性、突變率低的問題。

但是，由于等離子體誘變在改變DNA結構時，對細胞膜等結構也造成了破壞，所以造成了DNA和細胞結構的雙重損傷，所以細胞的存活率會大大下降。比如中國專利CN201410419831.2公開的一株活性嗜熱菌突變株及其在驅油方面的應用，其采用的等離子誘變操作方法所制作的存活曲線中，微生物的存活率從100％下降到了5％以下，中國專利CN201510004693.6公開的一種富核糖核酸啤酒酵母菌的誘變方法，微生物的存活率甚至下降到了接近0，雖然二者也成功篩選出了功能性較好的菌株，但是大量菌體的死亡使得正突變率不高，導致最終的誘變效率是較低的。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種常壓室溫等離子微生物誘變方法，提高了誘變過程中的微生物存活率，并且提高了正突變率，進而提高了誘變效率。

本發明的目的是提供一種常壓室溫等離子微生物誘變方法，利用常壓室溫等離子系統對活化的菌懸液進行誘變，誘變結束后利用細胞膜修復液洗脫，靜置修復，接著用生理鹽水重懸；

所述細胞膜修復液是由無菌水、磷脂、乙酰膽堿按照100:0.5-1:0.1-0.3的質量比例混合而成的。

優選的，上述常壓室溫等離子微生物誘變方法，所述細胞膜修復液是由無菌水、磷脂、乙酰膽堿按照100:0.5:0.3的質量比例混合而成的。

優選的，上述常壓室溫等離子微生物誘變方法，所述常壓室溫等離子系統的參數如下：工作氣體為氦氣、功率100W，工作氣體流量為10L/min，處理距離為2mm，活化的菌懸液用量為10μL。

優選的，上述常壓室溫等離子微生物誘變方法，細胞膜修復液的修復時間為40-60s。

優選的，上述常壓室溫等離子微生物誘變方法，修復結束后，4℃、12000rpm離心10min，棄上清，用生理鹽水重懸。

優選的，上述常壓室溫等離子微生物誘變方法，所述菌懸液為能夠產L-纈氨酸的谷氨酸棒狀桿菌的菌懸液。

優選的，上述常壓室溫等離子微生物誘變方法，所述菌懸液為能夠產L-纈氨酸的谷氨酸棒狀桿菌的菌懸液。

優選的，上述常壓室溫等離子微生物誘變方法，用于活化谷氨酸棒狀桿菌的液體培養基配方如下：蛋白胨5g、牛肉膏20g、氯化鈉5g、椰肉發酵物10-15g、蒸餾水1000mL，pH7.0-7.2，121℃滅菌后備用；

用于活化谷氨酸棒狀桿菌的斜面培養基的配方是在液體培養基配方的基礎上添加了相當于蒸餾水質量的1.5-2％的瓊脂。