[發明專利]非抗體依賴的泛素化修飾富集方法和檢測方法

在審

• 申請號: 202210220908.8
• 申請日: 2022-03-08
• 公開（公告）號: CN114609306A
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發明（設計）人: 張小飛;孫明偉;張青;鄔文峰;黃秋玲
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院;生物島實驗室
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/72
• 代理公司: 廣州廣典知識產權代理事務所(普通合伙) 44365
• 代理人: 萬志香

本發明公開了一種非抗體依賴的蛋白質泛素化修飾富集方法，包括全蛋白質提取、蛋白水平自由氨基完全封閉、底物蛋白上泛素鏈水解、含有可富集標簽試劑標記泛素化修飾位點處的自由氨基、蛋白質的酶切、標記的泛素化修飾肽段的富集。本發明還涉及檢測方法，即對富集后的泛素化修飾肽段通過液相?質譜檢測。本發明不需要利用抗體識別酶切后產生的泛素殘留基序，即可實現蛋白質泛素化修飾的無差別富集及鑒定。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種非抗體依賴的泛素化修飾富集方法和檢測方法。

背景技術

蛋白質翻譯后修飾在生物應對各種刺激并快速準確地調控生物過程中發揮重要作用。泛素化是一種廣泛存在的可逆蛋白質翻譯后修飾，它能調節底物蛋白的多種基本特征，包括穩定性、活性或定位等。泛素是真核生物中一種高度保守的含有76個氨基酸的小蛋白質。泛素的C端甘氨酸通過E1-E2-E3級聯反應與底物蛋白上賴氨酸殘基共價連接，同時該過程可由去泛素化酶逆轉。單個泛素分子修飾底物蛋白上的單個賴氨酸殘基，可形成單泛素化修飾。多個泛素分子修飾底物蛋白上的多個賴氨酸殘基，可形成多泛素化修飾。由于泛素分子本身含有7個賴氨酸殘基(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)，已經共價修飾到底物蛋白上的泛素分子自身攜帶的7個賴氨酸殘基還可繼續被其他泛素分子共價修飾，形成泛素鏈。此外，泛素分子蛋白N端的甲硫氨酸也有一個自由的氨基(M1)，該氨基也可被其他泛素分子共價修飾，形成線性泛素鏈。因此，細胞中可存在單泛素化、多泛素化以及8類不同形式的同質泛素鏈修飾。如果一個泛素鏈上結合泛素本身不同的賴氨酸殘基，形成混合或分支泛素鏈，則會進一步增加泛素鏈連接類型的復雜性。不同連接類型的泛素鏈被具有不同泛素結合域的效應蛋白識別，介導不同的信號通路。另外，泛素化修飾的動態變化控制著許多重要的生物過程，如細胞分裂、命運調控和遷移等。泛素化酶的功能或調控異常導致蛋白質泛素化修飾水平紊亂與多種疾病密切相關，如癌癥、神經退行性變等。泛素化蛋白質及其修飾位點的鑒定是研究泛素化修飾發揮何種生物功能的先決條件。因此，深度覆蓋的蛋白質泛素化修飾分析對研究其發揮生物學功能的分子機制具有重要意義。目前，基于質譜的蛋白質組學是研究蛋白質翻譯后修飾非常有效的方法但是，蛋白質泛素化修飾底物由于含量較低，難以進行直接分析。為了提高蛋白質泛素化修飾底物的鑒定靈敏度和覆蓋度，研究人員開發了一系列的富集方法對泛素化修飾蛋白質或肽段進行富集，如利用泛素結合結構域(UBDs)、泛素異位表達(Ectopic Expression)以及穩定的標記泛素交換體系(StableTagged Ubiquitin Exchange,StUbEx)對泛素化蛋白質或肽段進行富集，但是這些富集策略難以提供泛素化修飾位點的準確信息或樣品適用類型狹窄。由于泛素化修飾蛋白質經胰蛋白酶水解后，泛素化修飾位點會殘留雙甘氨酸修飾的賴氨酸(K-ε-GG)，因此通過抗K-ε-GG泛抗體富集及質譜分析可實現泛素化修飾位點準確鑒定。該實驗策略已廣泛應用于泛素化修飾組學研究(然而泛素樣蛋白質NEDD8和ISG15修飾底物的胰蛋白酶水解肽也含有K-ε-GG結構，因此抗K-ε-GG泛抗體難以將泛素化修飾肽段與泛素樣蛋白質的修飾肽段進行區分。Vyacheslav等使用胞內蛋白酶Lys-C對蛋白質進行酶切后，泛素化修飾位點殘留十三個氨基酸修飾的賴氨酸(K-ε-ESTLHLVLRLRGG)，避免了泛素樣蛋白質NEDD8和ISG15修飾底物的干擾。然而，泛素化位點上殘留的十三個氨基酸長度較長，會影響質譜對蛋白質泛素化位點的有效鑒定。另外，抗體對底物序列識別具有偏好性，不同批次抗體特異性存在差異，抗體富集方法成本也較高。因此，建立一種非抗體依賴的富集方法具有重要意義。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種非抗體依賴的蛋白質泛素化修飾富集方法。

實現上述目的技術方案包括如下。

一種蛋白質泛素化修飾富集方法，包括以下步驟：

S1、從待檢測生物樣品中提取獲得全蛋白質樣品；

S2、利用化學修飾方法對釋放出來的全蛋白質樣品中自由氨基進行封閉，得底物蛋白；