[發明專利]一種雙子葉植物多基因編輯載體及其構建方法

在審

• 申請號: 202210217286.3
• 申請日: 2022-03-07
• 公開（公告）號: CN114438123A
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 李喜鳳;朱誠;呂巧巧;李協;徐芳;卿菁
• 申請（專利權）人: 中量大黃山高質量發展研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/66;C12N5/10;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 王闖

1.一種雙子葉植物多基因編輯載體，其特征在于，所述多基因編輯載體包括啟動sgRNA的編碼DNA轉錄的啟動子、靶片段sgRNA轉錄的表達框、Cas9蛋白的表達框；

所述啟動sgRNA的編碼DNA轉錄的啟動子為AtU6和/或AtU3；

所述雙子葉植物多基因編輯載體是采用Overlapping PCR分別向所述啟動子和非靶片段sgRNA中連入帶有酶切位點的接頭，經酶切后連接獲得啟動子-非靶片段sgRNA載體；然后分別將靶片段sgRNA和酶切后的啟動子-非靶片段sgRNA載體連接，獲得帶有靶片段sgRNA轉錄的表達框的中間載體；

分別將多個帶有靶片段sgRNA轉錄的中間載體酶切后連接獲得啟動子調控的多元載體；然后利用限制性內切酶切割形成不同粘性末端將所述多元載體上的多個啟動子調控的靶片段sgRNA連接至帶有Cas9蛋白的表達框的載體中。

2.根據權利要求1所述的雙子葉植物多基因編輯載體，其特征在于，所述靶片段sgRNA轉錄的表達框為T1-sgRNA、T2-sgRNA和T3-sgRNA中的至少兩個，所述T1-sgRNA、T2-sgRNA和T3-sgRNA的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1-3所示。

3.根據權利要求2所述的雙子葉植物多基因編輯載體，其特征在于，所述啟動sgRNA的編碼DNA轉錄的啟動子選自AtU6-1、AtU6-26和AtU3b中的至少兩種；所述AtU6-1、AtU6-26和AtU3b的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.4-6所示。

4.根據權利要求1所述的雙子葉植物多基因編輯載體，其特征在于，所述Cas9蛋白的表達框包括：標簽序列、核定位序列、Cas9蛋白編碼序列和Cas9蛋白啟動子序列；

所述標簽序列選自c-myc、FLAG、V5、His、T7或HSV；

優選地，所述Cas9蛋白的表達框還包括熒光標記蛋白；

優選地，所述Cas9蛋白的編碼序列如SEQ ID NO.7所示；

優選地，所述Cas9蛋白啟動子序列選自下組：AtU6-1、AtU3b、AtU3d、AtU6-29、Actin、35S、Ubi、UBQ、SPL、CmYLCV和組織特異性啟動子YAO、CDC45、rbcS、誘導型啟動子XEV或其組合。

5.根據權利要求4所述的雙子葉植物多基因編輯載體，其特征在于，所述帶有Cas9蛋白的表達框的載體為帶有Cas9蛋白的表達框的農桿菌載體；

優選地，所述農桿菌載體選自重組pCAMBIA 1300、重組pCAMBIA 1301或重組pRI101-AN；

優選地，所述重組pCAMBIA 1301載體是將去除PMD18T的AtU6-26啟動子之后的載體經酶切連接獲得的重組pCAMBIA 1301載體；

優選地，所述雙子葉植物選自茄科、豆科、葫蘆科、十字花科、錦葵科或薔薇科；優選地，所述茄科選自番茄。

6.一種雙子葉植物基因組編輯的系統，其特征在于，其包括權利要求1-5任一項所述的雙子葉植物多基因編輯載體。

7.一種宿主細胞，其特征在于，包含有如權利要求1-5任一項所述的雙子葉植物多基因編輯載體或如權利要求6所述的雙子葉植物基因組編輯的系統；

優選地，所述宿主細胞為雙子葉植物細胞。

8.一種如權利要求1-5任一項所述的雙子葉植物多基因編輯載體的構建方法，其特征在于，其包括：

采用Overlapping PCR分別向啟動子和非靶片段sgRNA中連入帶有酶切位點的接頭，經酶切后連接獲得啟動子-非靶片段sgRNA載體；然后分別將靶片段sgRNA與酶切后的啟動子-非靶片段sgRNA載體連接，獲得帶有靶片段sgRNA轉錄的表達框的中間載體；

分別將多個帶有靶片段sgRNA轉錄的中間載體酶切后連接獲得啟動子調控的多元載體；然后利用限制性內切酶切割形成不同粘性末端將所述多元載體上的多個啟動子調控的靶片段sgRNA連接至帶有Cas9蛋白的表達框的載體中。