[發明專利]高通量簡化噬菌體基因組骨架的方法

有效

• 申請號: 202210212383.3
• 申請日: 2022-03-04
• 公開（公告）號: CN114934059B
• 公開（公告）日: 2023-02-21
• 發明（設計）人: 馬迎飛;袁盛建
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/10;C40B50/06;C12R1/19
• 代理公司: 深圳中一聯合知識產權代理有限公司 44414
• 代理人: 黃志云

本申請涉及生命科學技術領域，提供了一種高通量簡化噬菌體基因組骨架的方法。所述方法包括如下步驟：設計并合成噬菌體的CiPGr序列文庫，將CiPGr序列文庫與pTarget質粒骨架組裝，形成CiPGr質粒文庫；將CiPGr質粒進行轉化后提取CiPGr質粒；將CiPGr質粒轉化進入含有spCas9質粒的宿主細菌中，得到CiPGr質粒?細菌文庫；將野生型噬菌體和對應的CiPGr質粒?細菌文庫在培養基中培養，迭代培養，生成突變噬菌體庫；對間隔一定轉移次數后得到的突變噬菌體庫進行測序，確認所述噬菌體中的所有可刪除基因。本申請提供的方法，可以實現包括有尾噬菌體在內的所有噬菌體的基因組簡化。

技術領域

本申請涉及生命科學技術領域，具體涉及一種高通量簡化噬菌體基因組骨架的方法。

背景技術

噬菌體是地球上最豐富、最具基因多樣性的生物體。在一個多世紀的時間里，噬菌體研究一直是許多生物發現的關鍵，它為分子生物學提供了重要的生物技術工具。近年來，病毒宏基因組測序顯示，在人類腸道和其他環境中發現了大量噬菌體序列。這些序列的大部分(＞75％)是新型的，超過95％的序列屬于有尾雙鏈(ds)DNA噬菌體。此外，噬菌體已被認為是潛在的治療細菌感染的天然抗菌藥物。但同時，噬菌體作為潛在的治療細菌感染的天然抗菌藥物存在的宿主特異性、容易產生抗性等問題，直接影響噬菌體的成藥性。因此，科研工作者對噬菌體進行了許多合成生物學方面的努力，以克服這些限制。

無尾噬菌體如M13和X174，具有非常緊湊和較小的基因組(＜10kb)，由于編碼有限數量的基因相對簡單，使其易于編輯和理解其基因的功能。而有尾噬菌體的基因組通常數量相對較大(14～500kbp)且呈異常多樣化，這使得大規模獲得有尾噬菌體簡化基因組存在較大挑戰性。其中一個挑戰是：在基因組規模內，沒有有效的方法來識別噬菌體的非必需基因。比如模式噬菌體T7的25個非必需基因，是從最近三四十年的大量研究中積累知識中獲得的。噬菌體的擴增完全依賴其宿主，其獨特的自我傳播特性，使得在細菌中廣泛使用的方法(在微生物如大腸桿菌、酵母、芽孢桿菌和支原體中廣泛應用的簡化基因組方法，如同源重組、Tn5突變等)可能不適合大規模在有尾噬菌體中應用。此外，由于噬菌體基因組的高度多樣性的特征，使得通過生物信息方法比對很難獲得非必需基因信息。

從頭合成簡化基因組，需要高通量鑒定噬菌體的非必需基因，但高通量鑒定方法如dCas9方法，有兩個原因導致失敗：一是由于噬菌體基因組在細菌中會復制很多份，使許多噬菌體基因組的基因表達不能完全被dCas9抑制，導致假陽性結果；第二，噬菌體的基因很多是串聯轉錄的，dCas9抑制上游基因,將導致所有下游基因的抑制表達，導致了假陰性的結果。而Tn5類似的轉座子方法同樣由于噬菌體獨特的生長方式而導致鑒定效率下降。

發明內容

本申請的目的在于提供一種高通量簡化噬菌體基因組骨架的方法，旨在解決簡化噬菌體基因組的方法復雜，效率低的問題。

為實現上述申請目的，本申請采用的技術方案如下：

一種高通量簡化噬菌體基因組骨架的方法，包括如下步驟：

設計并合成兩種或兩種以上噬菌體的多個CiPGr序列文庫，將各所述CiPGr序列文庫中分別與pTarget質粒骨架組裝，形成CiPGr質粒文庫；其中，所述CiPGr序列文庫包括n個CiPGr序列，n為大于或等于2的自然數，所述CiPGr序列包含gRNA，且各所述CiPGr序列的gRNA不同；

將所述CiPGr質粒文庫中的CiPGr質粒進行轉化，篩選含有所述CiPGr質粒的轉化態細胞，從所述轉化態細胞中提取所述CiPGr質粒；將所述CiPGr質粒轉化進入含有spCas9質粒的宿主細菌中，得到CiPGr質粒-細菌文庫，所述CiPGr質粒-細菌文庫中含有n種CiPGr質粒-細菌；

將野生型噬菌體和對應的所述CiPGr質粒-細菌文庫在培養基中培養，取突變噬菌體產物轉移到新鮮的所述CiPGr質粒-細菌文庫中繼續培養，重復迭代培養，生成突變噬菌體庫；