[發明專利]一株野生型屎腸球菌ZK03及其電擊轉化方法和應用

在審

• 申請號: 202210207479.0
• 申請日: 2022-03-03
• 公開（公告）號: CN114480211A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 王瑋;謝改杰;金鑫鑫;張雪;黃燕華;曲慶
• 申請（專利權）人: 仲愷農業工程學院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N13/00;C12N15/74;A01N63/20;A01P1/00;A01P3/00;A23K10/18;C12R1/01
• 代理公司: 長春眾邦菁華知識產權代理有限公司 22214
• 代理人: 于曉慶

一株野生型屎腸球菌ZK03及其電擊轉化方法和應用，屬于微生物領域。該菌株已于2022年1月5日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號為：GDMCCNo:62192。該菌株不含腸球菌毒力因子Asa1、cylA、efaA、esp、gelE和hyl。該菌株具有良好的耐酸、耐豬膽鹽、耐高溫和耐生理鹽水特性，且在室溫生理鹽水中可長期存活；該菌株對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌具有一定抑制作用，可用于制備抑菌劑，同時還可作為飼料添加劑發酵生產飼料。本發明的一株野生型屎腸球菌ZK03的電擊轉化方法，操作簡單，轉化效率高，重復性強。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一株野生型屎腸球菌(Enterococcusfaecium)ZK03及其電擊轉化方法和應用。

背景技術

屎腸球菌(Enterococcus Faecium，E.faecium)是人和動物腸道正常菌群之一，屬于革蘭氏陽性球菌，無莢膜和鞭毛，具有良好的耐酸、耐高溫和耐膽鹽的性質。根據大量文獻報道，屎腸球菌能夠產生乳酸、細菌素、過氧化氫等物質，對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄菌等有一定的抑制作用。在食品中，屎腸球菌發酵有助于產生香氣和風味，延長貨架期，改善微生物環境。在畜牧養殖中，屎腸球菌常被用來作為替康產品之一，具有良好的應用前景。由于屎腸球菌具有較厚的細胞壁結構以及毒力基因的存在，限制了其發展和應用。

電轉化法是革蘭氏陽性細菌最常用的引入外源DNA分子的方法之一。但是目前關于專門適用于屎腸球菌電轉化的方法不是很多，因此，通常參考乳酸乳球菌電轉化的方法進行屎腸球菌的電轉化，由于屎腸球菌的異質性比較大，電轉化條件不均一，因此乳酸乳球菌電轉化方法應用在屎腸球菌上時存在轉化效率較低的問題，提高了轉化難度，且現有電轉化方法操作繁瑣，甚至難以獲得陽性轉化子。

發明內容

本發明的目的是提供一株野生型屎腸球菌(Enterococcus faecium)ZK03及其電擊轉化方法和應用。

本發明為解決技術問題所采用的技術方案如下：

本發明的一株野生型屎腸球菌(Enterococcus faecium)ZK03，該菌株已于2022年1月5日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號為：GDMCC No:62192。

作為優選的實施方式，該菌株不含有腸球菌毒力因子Asa1、cylA、efaA、esp、gelE和hyl。

本發明的一株野生型屎腸球菌(Enterococcus faecium)ZK03的電擊轉化方法，包括以下步驟：

步驟一、野生型屎腸球菌(Enterococcus faecium)ZK03感受態細胞的制備將活化的野生型屎腸球菌(Enterococcus faecium)ZK03接種于含1～3％(M/V)甘氨酸的改良培養基中，培養至平臺期或平臺后期，收集菌液，冰浴、離心收集菌體，用含30％(M/V)PEG1000的電擊緩沖液進行洗滌、重懸，置于-80℃保存；

步驟二、電擊轉化

按體積比為3:1的比例取野生型屎腸球菌(Enterococcus faecium)ZK03感受態細胞和穿梭質粒PAMB401，冰浴后混勻，加入預冷的電轉杯中靜置后，電擊1次，電壓為1400～2450V，電擊時間為4～5ms；加入復蘇培養基，取培養物涂布于篩選培養基中，完成電擊轉化過程。

作為優選的實施方式，步驟一中，所述改良培養基為含有171.15g/L蔗糖和2％(M/V)甘氨酸的BHI液體培養基。

作為優選的實施方式，步驟一中，所述電擊緩沖液的配制方法為：取100ml超純水經高壓濕熱滅菌處理后冷卻至50～60℃，加入30g PEG1000，0.45μm濾膜過濾除菌即得。