[發(fā)明專利]一種秋水仙素變溫誘導柳樹染色體加倍的方法

有效

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• 申請日: 2022-03-04
• 公開（公告）號: CN114521489B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發(fā)明（設計）人: 張健;楊杰;劉國元;李懿鑫;陳艷紅;魏輝;余春梅;鐘非
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: A01H1/08
• 分類號: A01H1/08;A01H1/00
• 代理公司: 南通億旸知識產(chǎn)權代理事務所(特殊普通合伙) 32578
• 代理人: 丁松鵬

1.一種秋水仙素變溫誘導柳樹染色體加倍的方法，其特征在于：采用秋水仙素溶液處理柳樹扦插苗，通過變溫誘導的方式，使其產(chǎn)生多倍體，以培育具有優(yōu)良性狀的柳樹，實現(xiàn)樹種改良；

具體步驟為：

（1）取樣：取樣時間為晚上7-8點，選擇生長狀態(tài)優(yōu)良的二倍體柳樹扦插苗，從主莖頂端剪取長度為2cm的嫩芽，并去除多余的葉片，在流水下沖洗5分鐘；

（2）滅菌：將步驟（1）中所得的嫩芽材料在超凈工作臺中先使用次氯酸鈉溶液浸泡消毒20秒，再使用濃度為75%的酒精浸泡消毒20秒，消毒好的材料立即轉(zhuǎn)移到無菌水中浸泡3分鐘，如此反復浸泡清洗6次，并用無菌濾紙將表面的水吸干；

（3）加倍培養(yǎng)基培養(yǎng)制備：將步驟（2）中消毒好的柳樹莖尖置于裝有加倍培養(yǎng)基的錐形瓶中，莖尖浸沒；所采用的加倍培養(yǎng)基為現(xiàn)用現(xiàn)配，避免過長時間放置；

所述步驟（3）中的加倍培養(yǎng)基配方為：MS粉末4.8g，蔗糖30g，6-BA 1g，NAA 5g，加超純水定容至1L，配比后的溶液再進行高溫滅菌，然后加入秋水仙素粉末2g，氨磷汀粉末10mg，充分溶解后避光靜置；

（4）變溫誘導：將步驟（3）中裝有培養(yǎng)基和柳樹莖尖的錐形瓶用透氣封口膜封好后放置4℃冰箱中低溫避光靜置培養(yǎng)4小時，隨后立即轉(zhuǎn)移到50-52℃的培養(yǎng)箱中高溫避光靜置培養(yǎng)2小時，最后將高溫處理后的材料轉(zhuǎn)移到25±2℃的搖床中以120rpm的轉(zhuǎn)速避光培養(yǎng)24小時；

（5）培養(yǎng)：將步驟（4）中處理好的材料從加倍培養(yǎng)基中取出，放入無菌水中浸泡4分鐘，如此反復浸泡清洗8次，用無菌濾紙吸干表面的水分，然后將莖尖的形態(tài)學下端豎直插入到裝有增殖培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，插入深度為0.5-0.8cm，培養(yǎng)瓶用透明透氣封口膜封住，即可進行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中培養(yǎng)瓶需要置于以下條件中進行培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強度為1500-2000lux，光照周期為16小時紅光與白光，兩者的光照比例為1:1，然后再是8小時黑暗；

（6）測定：培養(yǎng)20-25天后，剪取其新生葉，用流式細胞術進行染色體倍性的測定，測定過程以未加倍的材料的新葉作為對照，對照后發(fā)現(xiàn)，加倍后的新葉會出現(xiàn)兩種情況，一種為二倍體和四倍體的嵌合體的材料，另一種為純四倍體材料；

（7）純化：將步驟（6）中測定結果為二倍體和四倍體的嵌合體的材料繼續(xù)培養(yǎng)成植株，待其枝條直徑達到5mm以上時，分別剪取不同部位枝條上的葉片上部進行倍性測定，當測定為四倍體時，取葉片下部，連同葉柄一起剪下，再進行扦插培養(yǎng)，即可獲得純四倍體植株。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種秋水仙素變溫誘導柳樹染色體加倍的方法，其特征在于：所述步驟（2）中的次氯酸鈉溶液中的氯含量為6-14%。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種秋水仙素變溫誘導柳樹染色體加倍的方法，其特征在于：所述步驟（5）中的增殖培養(yǎng)基包括以下成分：MS粉末4.8g，蔗糖30g，6-BA 1g，NAA 5g，瓊脂8g，加超純水定容至1L，配比后的溶液再進行高溫滅菌，冷卻后備用。