[發明專利]檢測非洲豬瘟病毒的引物、探針、試劑盒和iiPCR方法

在審

• 申請號: 202210199566.6
• 申請日: 2022-03-02
• 公開（公告）號: CN114540549A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 岳華;湯承;陳雪蓉
• 申請（專利權）人: 西南民族大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 成都華風專利事務所(普通合伙) 51223
• 代理人: 杜朗宇

1.一種檢測非洲豬瘟病毒的引物和探針，其特征在于，包括檢測非洲豬瘟病毒的引物、探針；

所述引物分為上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根據權利要求1所述的引物和探針，其特征在于，探針的核苷酸序列的5'端連接有熒光基團，3'端連接有非熒光淬滅基團和淬滅基團；

所述熒光基團選自FAM、TET、HEX、CY3、JOE中的一種，進一步為FAM；

淬滅基團選自MGB、BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、Eclipse中的一種，進一步為MGB。

3.一種檢測非洲豬瘟病毒的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1或2所述的引物和探針。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括反應緩沖液、Taq酶、反轉錄酶、陽性對照品和陰性對照品、dNTPs。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，反應緩沖液由以下組分構成：500mMKCl、100mMTris-HCl、15mM MgCl₂，加ddH₂O至體積總量為3ml，pH 8.0～8.5。

6.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，Taq酶的終濃度為5U·μL^-1，反轉錄酶的終濃度為20U·μL^-1。

7.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，陽性對照品為含有非洲豬瘟病毒DNA片段的樣品；

進一步地，陽性對照品通過以下方法制備得到：將含有非洲豬瘟病毒DNA片段的DNA樣品100μL裝入PCR管內，降溫至-40～-80℃，然后在8～12pa氣壓下凍干形成干粉狀。

8.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，陰性對照品為無非洲豬瘟病毒DNA片段的樣品；

進一步地，陰性對照品通過以下方法制備得到：將無非洲豬瘟病毒DNA片段的樣品100μL裝入PCR管內，降溫至-40～-80℃，然后在8～12pa氣壓下凍干形成干粉狀。

9.根據權利要求3～8任一項所述的試劑盒，其特征在于，非洲豬瘟病毒的上游引物和下游引物的終濃度均為10μmol·μL^-1，探針的終濃度為10μmol·μL^-1；

dNTPs的終濃度為2.5mM。

10.一種檢測非洲豬瘟病毒的iiPCR方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)制備DNA模板：提取非洲豬瘟病毒的總DNA，制備得到DNA模板；

2)建立iiPCR反應體系：

取100μL反應緩沖液加入到陽性對照品中混合，制備得到陽性對照品，然后取50μL反應緩沖液和5μL陽性對照品加入熒光定量PCR反應液凍干管中，制備得到陽性對照反應體系；

取100μL反應緩沖液加入陰性對照品凍干管中，制備得到陰性對照品，然后取50μL反應緩沖液和5μL陰性對照品加入熒光定量PCR反應液凍干管中，制備得到陰性對照反應體系；

取50μL反應緩沖液和5μL檢測樣本DNA加入熒光定量PCR反應液凍干管中，制備得到檢測樣本DNA反應體系；

然后分別從各個反應體系中取50μL混合物移入恒溫隔絕式熒光PCR反應管中；

將制備好的熒光定量PCR反應管瞬時高速離心5s，避免出現氣泡；

3)擴增檢測：把PCR反應管放置于恒溫隔絕式熒光PCR儀器反應，結果顯示“+”表示陽性，“-”表示陰性。